王永春，伍 靜，張 舒，曹新生，王 冰，石 菲，楊長斌，高 原，杜挺媛，趙疆東，孫喜慶第四軍醫(yī)大學(xué) 航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天生物動力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安7003；第四軍醫(yī)大學(xué) 訓(xùn)練部，陜西西安 7003

在航天飛行時，重力的消失將引起人體生理系統(tǒng)明顯改變，特別是在中長期失重環(huán)境下，可引起機(jī)體出現(xiàn)廣泛的心血管系統(tǒng)變化，在心臟中可表現(xiàn)出心肌萎縮、心律失常和心肌代謝異常等變化，嚴(yán)重威脅航天員的安全[1]。失重環(huán)境導(dǎo)致的心血管功能失調(diào)已成為妨礙航天員健康和太空探索能力最重要的難題之一，如何改善心臟功能，維持心血管功能的穩(wěn)定，已成為防治失重致心血管功能變化的關(guān)鍵所在。心肌細(xì)胞凋亡在心血管疾病中廣泛存在，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量和程度的變化對心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展具有直接影響。有關(guān)模擬失重環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4(GATA-4)和心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(MEF2A)在細(xì)胞的生長發(fā)育、損傷修復(fù)及細(xì)胞存活中具有重要的調(diào)節(jié)作用[2-3]。本研究以大鼠心肌細(xì)胞為研究對象，旨在觀察回轉(zhuǎn)器模擬失重對大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)通路基因及蛋白的影響，為深入研究航天飛行中機(jī)體心臟凋亡的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑與儀器 1~3 d齡新生Sprague Dawley大鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)，RNA提取試劑盒(Promega公司)，RT-PCR試劑盒(Takara公司)，GATA-4和MEF2A一抗分別購自Immunoway公司，c-myc一抗和羊抗兔二抗購自ABcom公司，ECL發(fā)光試劑盒(Pierce公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Kendro實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品公司)，Nikon TS100倒置顯微鏡(Nikon公司)，超凈工作臺(蘇州凈化)，細(xì)胞培養(yǎng)專用2D-RWVs回轉(zhuǎn)器(北京科林恒達(dá)科技發(fā)展有限公司)，凝膠圖像分析系統(tǒng)(北京天能公司)。

2 細(xì)胞處理及分組 實(shí)驗(yàn)分為96 h回轉(zhuǎn)組和對照組。心肌細(xì)胞以含100 ml/L FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。模擬失重前1 d，將心肌細(xì)胞以每片1×105個的細(xì)胞密度接種于2.55 cm×2.15 cm的玻片上，置于6孔板中于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將玻片插入回轉(zhuǎn)艙中并灌滿培養(yǎng)液，以30 r/min的速度水平回轉(zhuǎn)即可完成心肌細(xì)胞模擬失重的模擬。對照組置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中平行培養(yǎng)。細(xì)胞分別在回轉(zhuǎn)和1 G重力環(huán)境下培養(yǎng)96 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 RT-PCR檢測 提取各組細(xì)胞的總RNA，以紫外分光光度法計算總RNA的濃度，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA待用。采用25 μl反應(yīng)體系，其中引物序列為：1)內(nèi)參GAPDH：上游引物：5'-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3'，下游引物：5'-CGGCCATCACGCCAC AGTTT-3'；2)擴(kuò)增c-myc：上游引物：5'-AACTTACAATCTGCGAGCCA-3'，下游引物：5'-AGCAGCTCGAATTT CTTCCAGATAT-3'。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以陽性目的條帶/GAPDH基因條帶光密度的比值作為目的mRNA的相對表達(dá)量。

4 Western Blot檢測 用RIPA lysis buffer 200μl裂解細(xì)胞并提取蛋白，BCA法蛋白定量，取20 μg的細(xì)胞蛋白抽提液行SDS-PAGE電泳分離，繼而轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉3 h，分別加入c-myc抗體(1∶1 000)、GATA-4抗體(1∶500)及MEF2A抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，HRP辣根過氧化酶二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色。用GAPDH為內(nèi)參照，以陽性條帶與內(nèi)參照光密度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)值。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)均在相同條件下重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以-x±s表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較結(jié)果采用單因素方差分析F檢驗(yàn)，統(tǒng)計學(xué)差異檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。

結(jié) 果

1 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的改變 對照組c-myc mRNA及蛋白呈低量表達(dá)，而回轉(zhuǎn)模擬失重96 h組大鼠心肌細(xì)胞c-myc mRNA及蛋白的表達(dá)與對照組相比均顯著增加(P＜0.05)，見圖1。

圖 1 模擬失重對心肌細(xì)胞c-myc mRNA和蛋白表達(dá)的影響A： mRNA結(jié)果； B： 蛋白結(jié)果 與對照組比較， aP＜0.05Fig. 1 Effect of simulated microgravity on expression of c-myc mRNA (A) and protein (B)in myocardiocytes

圖 2 模擬失重對心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-4蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較， aP＜0.05(左)圖 3 模擬失重對心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子MEF2A蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較， aP＜0.05(右)Fig. 2 Effect of simulated microgravity on expression of GATA-4 protein in myocardiocytes(left)aP＜0.05, vs control groupFig. 3 Effect of simulated microgravity on expression of MEF2A protein in cardiomyocytes(right)aP＜0.05, vs control group

2 轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和MEF2A表達(dá)的改變 轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和MEF2A在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起重要作用，本研究對兩者的表達(dá)進(jìn)行了檢測。心肌細(xì)胞回轉(zhuǎn)模擬失重96 h后，轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和MEF2A蛋白與對照組相比顯著下降(P＜0.05)，提示模擬失重可致轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和MEF2A蛋白表達(dá)降低，見圖2、3。

討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，所有航天員在飛行后都會出現(xiàn)不同程度的心血管系統(tǒng)適應(yīng)不良，主要表現(xiàn)為立位耐力下降與運(yùn)動耐力降低；輕者立位時出現(xiàn)心率增快、血壓驟降、頭暈等；重者在立位時立即發(fā)生暈厥，嚴(yán)重影響了航天員的健康以及航天任務(wù)的完成，成為中長期載人航天的主要限制因素[4]。

航天醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，失重或模擬失重環(huán)境可導(dǎo)致心臟出現(xiàn)每搏量減少、收縮功能降低和心肌電活動異常等變化，并觀察到失重或模擬失重后，動物出現(xiàn)心肌萎縮、心肌細(xì)胞脂滴及糖元增多和線粒體變性等結(jié)構(gòu)改變[5]。提示航天飛行后心臟結(jié)構(gòu)及功能的變化可能在失重后心血管適應(yīng)不良中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重可致肺組織細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，尾懸吊模擬失重大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率較對照組增高[6-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重致體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡相關(guān)調(diào)控分子c-myc基因及蛋白的表達(dá)均顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了模擬失重可增加心肌細(xì)胞凋亡。然而，有關(guān)失重/模擬失重環(huán)境下所致的心肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制卻鮮見報道。有研究顯示，PI3K/Akt信號通路在心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[10]。本研究結(jié)果表明，模擬失重96 h可致心肌細(xì)胞的凋亡基因及蛋白表達(dá)增加；同時對細(xì)胞凋亡有重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子GATA-4表達(dá)顯著降低，而轉(zhuǎn)錄因子MEF2A表達(dá)顯著增加；提示模擬失重96 h所致心肌細(xì)胞凋亡顯著增加可能存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制。

GATA結(jié)合蛋白家族廣泛存在于動植物和真菌、線蟲等體內(nèi)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化的重要轉(zhuǎn)錄因子。GATA-4是調(diào)控心臟基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與了心臟正常發(fā)育、功能基因表達(dá)和心肌肥大的病理過程，還在心肌重塑過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11]。實(shí)驗(yàn)證明，過表達(dá)GATA-4能使體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞表面積增大，肌小節(jié)增生，胞內(nèi)總蛋白積累顯著增多；而過表達(dá)GATA-4的成年轉(zhuǎn)基因小鼠可檢測到心肌肥厚相關(guān)基因如ANF和內(nèi)皮素等的激活[12]。除了調(diào)控細(xì)胞的生長以及分化外，GATA-4還在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，GATA-4活性的降低可致大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而恢復(fù)GATA-4活性水平可減弱凋亡水平。近期也有研究發(fā)現(xiàn)，GATA-4通過調(diào)節(jié)bcl-2的激活而決定細(xì)胞是凋亡還是存活[14]。GATA-4對抗凋亡蛋白bcl-2具有重要調(diào)節(jié)作用，在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，過表達(dá)GATA-4可提高bcl-2的基礎(chǔ)表達(dá)，而特異性抑制GATA-4的表達(dá)，bcl-2的表達(dá)水平則大幅度降低。

MEF2屬于轉(zhuǎn)錄因子MADS-box家族，由一個MADS結(jié)構(gòu)域和N端MEF2特定結(jié)構(gòu)域組成。脊椎動物的MEF2基因家族共有四個成員：MEF2A，MEF2B，MEF2C，MEF2D，分別定位于不同的染色體上。MEF2A蛋白定位于15q26染色體上，由507個氨基酸組成。MEF2的突出功能是控制肌細(xì)胞分化過程中的基因轉(zhuǎn)錄，維持心肌細(xì)胞構(gòu)造的完整和保持適當(dāng)?shù)木€粒體容量。MEF2蛋白在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖以及生存與凋亡中發(fā)揮重要作用。研究表明，MEF2的轉(zhuǎn)錄活性在維持線粒體功能活性中起重要作用，抑制MEF2的活性可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)線粒體功能降低，活性氧簇超量表達(dá)及細(xì)胞凋亡的增加[15]。已有研究證實(shí)，MEF2家族成員可與GATA-4直接相互作用激活下游基因的表達(dá)，GATA4通過其C末端的鋅指結(jié)構(gòu)域與MEF2蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接作用，形成GATA4-MEF2復(fù)合體[16]。這說明GATA-4和MEF2A之間有一定聯(lián)系，可能通過協(xié)同作用共同參與調(diào)節(jié)成年心肌細(xì)胞的凋亡和存活。本研究結(jié)果表明，模擬失重96 h可致心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子MEF2A基因及蛋白水平表達(dá)降低，與GATA-4的表達(dá)趨勢一致。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，回轉(zhuǎn)器模擬失重96 h可引起體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡增加，心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和MEF2A表達(dá)降低可能在模擬失重所致的心肌細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡，對它們的干預(yù)是否能防止心肌細(xì)胞凋亡，將是我們下一步研究的內(nèi)容。

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