范曉娟， 朱紅梅， 韓士群， 周 慶， 楊天元， 王世梅

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095;2.蘇州市吳江區(qū)松陵鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，江蘇 蘇州 215200;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，江蘇 南京 210014)

隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，采用水葫蘆等水生植物消減水體氮、磷等富營(yíng)養(yǎng)化物質(zhì)成為改善水質(zhì)的重要措施，但大量水葫蘆若堆積又會(huì)產(chǎn)生二次污染，亟需進(jìn)行資源化利用。現(xiàn)有水葫蘆資源化利用方式中，較為普遍的是將其與其他物料如污水塘底泥、動(dòng)物糞便等混合進(jìn)行好氧或厭氧堆制，產(chǎn)生沼氣及制得有機(jī)肥［1-5］或制成動(dòng)物飼料［6-7］。近年來(lái)，由于能源危機(jī)日益加劇，水葫蘆等水生植物作為生物質(zhì)能利用的研究逐漸引起科技工作者們的興趣。

水葫蘆有較高的可發(fā)酵物質(zhì)，具有較強(qiáng)的產(chǎn)沼氣潛力［8-9］，但其木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)和含量是生產(chǎn)沼氣的瓶頸［9-10］。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，而降解木質(zhì)纖維素的關(guān)鍵是去除木質(zhì)素［11-12］。為了提高沼氣產(chǎn)率，需要對(duì)水葫蘆進(jìn)行一定的預(yù)處理。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者也已對(duì)水葫蘆發(fā)酵的預(yù)處理做了大量研究，如Moorhead等［8］認(rèn)為適當(dāng)?shù)乃J粒徑可以提高沼氣總產(chǎn)量以及甲烷產(chǎn)量;Patel等［13］發(fā)現(xiàn)利用熱化學(xué)方法將水葫蘆預(yù)處理后厭氧發(fā)酵可以提高沼氣產(chǎn)量;陳曉曄等［14］的研究表明一定濃度的硫酸預(yù)處理可以提高水葫蘆的甲烷產(chǎn)量且縮短系統(tǒng)啟動(dòng)期。上述預(yù)處理大多采用物理、化學(xué)方法，而關(guān)于微生物預(yù)處理水葫蘆的研究不多。

白腐真菌是對(duì)木質(zhì)素具有最強(qiáng)降解能力的一類真菌，經(jīng)其轉(zhuǎn)化后的稻草基質(zhì)用于沼氣生產(chǎn)時(shí)，其纖維素酶的釋放能力比原稻草要高4.3倍［15］。從理論上講，利用白腐菌生物預(yù)先降解木質(zhì)纖維素含量較高的秸稈，以提高隨后的厭氧消化產(chǎn)氣率是可行的。Ghost［16］等研究發(fā)現(xiàn)白腐菌黃孢原毛平革菌菌絲體4 d后表現(xiàn)出巨大的木質(zhì)素降解能力，3周后其菌絲體對(duì)秸稈木質(zhì)素的降解率為47.51%，稻秸的生物氣和甲烷產(chǎn)量分別提高了34.73%和46.19%。本研究將采用白腐真菌的黃孢原毛平革菌和糙皮側(cè)耳，分別對(duì)水葫蘆木質(zhì)纖維素進(jìn)行降解預(yù)處理，并研究其對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響，探求水葫蘆高效產(chǎn)沼氣的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

水葫蘆:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院2號(hào)塘，洗凈，風(fēng)干，總固體含量(TS)為91.45%。

菌種:黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)，由本實(shí)驗(yàn)室留存。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液:KH2PO40.20 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCl20.01 g/L和1 ml/L無(wú)機(jī)鹽溶液，維生素B1100 mg/L，吐溫-80 0.05%［17］。無(wú)機(jī)鹽溶液為0.50 g/L MnSO4·H2O，0.01 g/L AlK(SO4)2·12H2O，0.01 g/L H3BO3，0.01 g/L Na2MoO4· 2H2O，0.10 g/L FeSO4·7H2O，0.10g/L CoCl2· 6H2O，0.10 g/L ZnSO4·7H2O，0.01 g/L CuSO4· 5H2O，3.00 g/L MgSO4·7H2O［18］。

厭氧消化試驗(yàn)所用沼液總固體(TS)含量為2.16%，揮發(fā)性固體(VS)為56.55%，pH為8.34。

1.2 方法

1.2.1 水葫蘆木質(zhì)纖維素的降解試驗(yàn) 將黃孢原毛平革菌和糙皮側(cè)耳分別在30℃和28℃溫度下活化，150 r/min轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)7 d后，用滅菌濾紙過(guò)濾，滅菌水沖洗3次，至濾紙不再滴水。

稱取自然風(fēng)干、粉碎過(guò)20目篩的水葫蘆40 g于1 000 ml錐形瓶中，按固液比1∶2加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，自然pH，加水調(diào)節(jié)含水率至75%，封口后于120℃下滅菌30 min。冷卻至室溫后以20%的接種量(以濕重計(jì))接種上述過(guò)濾得到的菌體，接種后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，調(diào)節(jié)濕度75%，分別在30℃和28 ℃溫度下培養(yǎng)，分別于5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d取樣，測(cè)定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等指標(biāo)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 降解產(chǎn)物的厭氧發(fā)酵試驗(yàn) 試驗(yàn)所用發(fā)酵裝置為自制簡(jiǎn)易裝置，見(jiàn)圖1。發(fā)酵瓶為1 L的廣口瓶，瓶口改用膠塞，膠塞上有兩孔，插入玻璃管后用橡膠管連接，分別為取樣口和導(dǎo)氣口，發(fā)酵罐與集氣瓶之間的導(dǎo)氣管連接一個(gè)取氣裝置。氣體收集瓶為1 L，采用排水法收集氣體，通過(guò)測(cè)量排出水的體積獲得沼氣產(chǎn)量。

采用濕發(fā)酵方法:取TS為39.36 g預(yù)處理10 d、15 d、25 d后發(fā)酵原料(濕料)，加入接種沼液400 g(TS為2.16%)，加水將發(fā)酵物總質(zhì)量調(diào)整至600 g，此時(shí)發(fā)酵罐里的TS負(fù)荷均為8%。密封后，于35±1℃下進(jìn)行厭氧發(fā)酵。對(duì)照處理為不加菌體的原料，同時(shí)設(shè)置只添加厭氧消化沼液不添加發(fā)酵材料的沼液對(duì)照，以扣除接種沼液本身產(chǎn)氣量。每個(gè)處理做2個(gè)重復(fù)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

圖1 厭氧發(fā)酵裝置結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic map of anaerobic digestion equipment

表1 厭氧發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of the anaerobic digestion experiment

1.2.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法 采用范氏法(Van Soest)［19］測(cè)定纖維素、半纖維素和木質(zhì)素;以排水集氣法收集氣體，每日測(cè)定產(chǎn)氣量;采用GC-9890A氣相色譜儀分析沼氣中甲烷含量(TCD檢測(cè)器);干物質(zhì)的測(cè)定采用105℃烘24 h差重法;pH值采用雷磁pHS-2F型酸度計(jì)測(cè)定;揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的測(cè)定采用比色法。

1.2.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)均扣除空白對(duì)照樣后進(jìn)行后續(xù)處理與分析。數(shù)據(jù)均用Sigma-Plot10、SPSS13.0軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 降解過(guò)程中水葫蘆木質(zhì)纖維素含量的變化

由圖2可見(jiàn)，黃孢原毛平革菌和糙皮側(cè)耳兩種白腐菌對(duì)木質(zhì)素、纖維素、半纖維素均有不同程度的降解，對(duì)木質(zhì)素的降解較為明顯，接種30 d后，木質(zhì)素含量分別降到6.93%、8.36%，降解率分別為39.42%和26.92%。兩種白腐菌均在接種第10 d就對(duì)木質(zhì)素有較強(qiáng)的降解效果。木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率均隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加，30 d后兩菌對(duì)纖維素的降解率分別為15.39%、13.44%;對(duì)半纖維素的降解率分別為16.77%、14.42%。

2.2 水葫蘆厭氧發(fā)酵的產(chǎn)酸特征

各處理在反應(yīng)過(guò)程中pH值和揮發(fā)性脂肪酸的濃度有著相反的變化趨勢(shì)(圖3)，揮發(fā)性脂肪酸濃度升高時(shí)pH值下降。水葫蘆厭氧發(fā)酵酸化速度很快，各處理的pH值均在第2 d就達(dá)到最低值，黃孢原毛平革菌預(yù)處理10 d、15 d、25 d各組的最低值分別為7.40、7.56、7.31，糙皮側(cè)耳預(yù)處理10 d、15 d、25 d 各組的最低值分別為 7.14、7.15、7.39，對(duì)照組的最低值為7.22。各處理組的pH在達(dá)到最低值后隨即開(kāi)始回升，第5 d至第30 d穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，隨后顯著下降。相應(yīng)的，各處理的揮發(fā)性脂肪酸濃度在發(fā)酵第2 d達(dá)到最高，其中黃孢原毛平革菌預(yù)處理10 d、15 d、25 d各組的揮發(fā)性脂肪酸最高濃度分別為1 010.15 mg/L、1 446.70 mg/L、936.55 mg/L，由糙皮側(cè)耳預(yù)處理10 d、15 d、25 d的揮發(fā)性脂肪酸最高濃度分別為1 524.11 mg/L、1 366.75 mg/L、1 120.56 mg/L，對(duì)照組的揮發(fā)性脂肪酸最高濃度為2 395.94 mg/L。各處理組的揮發(fā)性脂肪酸濃度達(dá)到最高值后開(kāi)始下降，在第7 d達(dá)到一個(gè)較低的穩(wěn)定值，而對(duì)照組在第11d才達(dá)到較低穩(wěn)定值，并持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束。以對(duì)照為例，統(tǒng)計(jì)分析得，揮發(fā)性脂肪酸濃度與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.840＊＊，P＜0.01)，表明水葫蘆水解產(chǎn)生的有機(jī)酸是造成發(fā)酵液中pH值下降的最重要原因。

圖2 降解過(guò)程中木質(zhì)纖維素含量的變化Fig.2 The variation of lignocellulose content in the process of degradation

圖3 厭氧發(fā)酵中發(fā)酵液pH值和揮發(fā)性脂肪酸濃度的變化Fig.3 Changes of pH values and valotile fatty acid contents during anaerobic digestion of water hyacinth

2.3 水葫蘆厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣特征

2.3.1 日產(chǎn)氣量 從圖4a、4b可見(jiàn)，各處理厭氧反應(yīng)期間的日產(chǎn)氣量變化趨勢(shì)大致相同，均在3～5 d達(dá)到第1個(gè)產(chǎn)氣最高峰，然后下降并且持續(xù)一段時(shí)間后在25～27 d達(dá)到第2個(gè)產(chǎn)氣高峰，此后一直維持在一個(gè)較低的產(chǎn)氣量水平，直至發(fā)酵結(jié)束;水葫蘆發(fā)酵的啟動(dòng)時(shí)間較快，發(fā)酵第1 d就達(dá)到一個(gè)較高的產(chǎn)氣量。由糙皮側(cè)耳處理了10 d、15 d的兩組和對(duì)照組在發(fā)酵第2 d日產(chǎn)氣量驟降，1～2 d后就迅速回升，達(dá)到一個(gè)產(chǎn)氣高峰(圖4b)，而由黃孢原毛平革菌處理的各組日產(chǎn)氣量在第2 d并沒(méi)有出現(xiàn)下降現(xiàn)象而是持續(xù)增加至第1個(gè)產(chǎn)氣高峰(圖4a)。

圖4 水葫蘆厭氧發(fā)酵過(guò)程中日產(chǎn)氣量的變化Fig.4 Daily biogas production during anaerobic digestion of water hyacinth

2.3.2 累積產(chǎn)氣量 對(duì)各處理在厭氧反應(yīng)期間的產(chǎn)氣進(jìn)行累積計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5顯示，對(duì)照組在28 d就停止了產(chǎn)氣，而兩菌10 d和15 d的處理組則繼續(xù)產(chǎn)氣直至發(fā)酵結(jié)束。由黃孢原毛平革菌預(yù)處理10 d、15 d，累積產(chǎn)氣量分別較對(duì)照提高了48.72%、59.11%(圖5a);經(jīng)糙皮側(cè)耳處理10 d、15 d的累積產(chǎn)氣量分別較對(duì)照提高了70.96%、75.05%(圖5b)。而由黃孢原毛平革菌預(yù)處理25 d和由糙皮側(cè)耳預(yù)處理25 d的兩組累積產(chǎn)氣量分別下降了13.31%和76.54%。

圖5 水葫蘆厭氧發(fā)酵中累積產(chǎn)氣量的變化Fig.5 Accumulative biogas production during anaerobic digestion of water hyacinth

2.3.3 甲烷含量 從圖6可見(jiàn)，各處理甲烷含量的變化趨勢(shì)大體一致:在發(fā)酵前4 d，甲烷含量呈直線趨勢(shì)迅速上升，第5 d、第6 d繼續(xù)緩慢上升達(dá)到各自的一個(gè)較穩(wěn)定的值，此后甲烷含量變化不大并維持較長(zhǎng)一段時(shí)間，發(fā)酵進(jìn)行到25 d后，各處理組及對(duì)照組的甲烷含量稍有下降。第6 d時(shí)，由黃孢原毛平革菌分別預(yù)處理10 d、15 d、25 d的3組甲烷含量分別為50.63%、55.16%、51.47%(圖6a);由糙皮側(cè)耳分別預(yù)處理10 d、15 d、25 d的3組甲烷含量分別為56.85%、55.47%、54.57%(圖6b)，而對(duì)照組的甲烷含量為59.87%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，黃孢原毛平革菌各處理組和糙皮側(cè)耳多處理組的甲烷含量與對(duì)照組的甲烷含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖6 水葫蘆厭氧發(fā)酵所產(chǎn)沼氣中甲烷含量的變化Fig.6 Dynamics of methane content during anaerobic digestion of water hyacinth

2.3.4 單位TS產(chǎn)氣量和單位TS甲烷產(chǎn)量 從表2可見(jiàn)，由黃孢原毛平革菌預(yù)處理10 d、15 d，水葫蘆單位TS產(chǎn)氣量分別較對(duì)照提高48.73%、59.11%;由糙皮側(cè)耳處理10 d、15 d，水葫蘆單位TS產(chǎn)氣量分別較對(duì)照提高70.96%、75.05%。處理25 d時(shí)黃孢原毛平革菌和糙皮側(cè)耳兩組的單位TS產(chǎn)氣量反而分別下降了13.31%、76.55%。對(duì)于單位TS甲烷產(chǎn)量，由黃孢原毛平革菌預(yù)處理10 d、15 d，TS甲烷產(chǎn)量較對(duì)照分別提高了30.53%、35.44%;由糙皮側(cè)耳處理10 d、15 d，TS甲烷產(chǎn)量較對(duì)照分別提高了54.28%、55.81%。處理25 d時(shí)，黃孢原毛平革菌和糙皮側(cè)耳兩組單位TS甲烷產(chǎn)量分別下降了21.80%和77.33%(表2)。

表2 水葫蘆的產(chǎn)氣情況Table 2 Gas production during anaerobic digestion of water hyacinth

3 討論

3.1 白腐菌對(duì)木質(zhì)纖維素的降解效果

由于纖維素易與半纖維素、木質(zhì)素等難分解的物質(zhì)相復(fù)合，利用纖維素之前，必須把它從木質(zhì)素和半纖維素包裹中釋放出來(lái)，而半纖維素比木質(zhì)素易降解，因此，纖維素的分解關(guān)鍵就在于木質(zhì)素的降解［12］。杭怡瓊等［20］用稻草秸稈作基質(zhì)接種不同白腐菌株，白腐菌對(duì)木質(zhì)素的降解率平均可達(dá)37.76%。本試驗(yàn)中，接種30 d，黃孢原毛平革菌和糙皮側(cè)耳對(duì)木質(zhì)素的降解率分別為39.42%和26.92%，與稻草木質(zhì)素降解效果相近。同時(shí)纖維素和半纖維素也有不同程度的降解，接種30 d，黃孢原毛平革菌對(duì)水葫蘆纖維素、半纖維素的降解率分別為15.39%、16.77%，糙皮側(cè)耳對(duì)其纖維素、半纖維素的降解率分別為13.44%，14.42%，而趙華等［21］用白腐菌在固態(tài)培養(yǎng)條件培養(yǎng)25 d后對(duì)稻草秸稈中纖維素、半纖維素的降解率分別為25.10%和29.80%，水葫蘆的纖維素、半纖維素降解率低于稻草。

3.2 水葫蘆厭氧發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)酸特性

揮發(fā)性脂肪酸是厭氧消化過(guò)程中極為重要的一個(gè)中間產(chǎn)物，也是最重要的產(chǎn)甲烷前體物質(zhì)，在發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)揮發(fā)性脂肪酸和pH值的監(jiān)控對(duì)于系統(tǒng)的正常運(yùn)行及較高的沼氣質(zhì)量都是非常重要的。統(tǒng)計(jì)分析得，各處理組與對(duì)照組的揮發(fā)性脂肪酸含量無(wú)顯著性差異(F=0.549，P=0.769)。對(duì)揮發(fā)性脂肪酸含量與產(chǎn)氣量進(jìn)一步分析，揮發(fā)性脂肪酸的高峰值出現(xiàn)在產(chǎn)氣量增加的前期，這是由于有機(jī)酸的大量積累造成pH值降低，從而影響了產(chǎn)甲烷菌的活性，但與此同時(shí)，揮發(fā)性脂肪酸的積累也為甲烷菌生長(zhǎng)繁殖提供了大量的物質(zhì)來(lái)源，隨著產(chǎn)甲烷菌活性逐步增加，有機(jī)酸底物隨后被甲烷菌充分利用后形成了產(chǎn)氣高峰［22］。統(tǒng)計(jì)分析可知，由糙皮側(cè)耳處理10 d、15 d的兩組揮發(fā)性脂肪酸含量與日產(chǎn)氣量均呈顯著正相關(guān)(r=0.703*，P＜0.05;r=0.679*，P＜0.05);其他處理的揮發(fā)性脂肪酸含量與日產(chǎn)氣量相關(guān)性不顯著(P＞0.05)。

3.3 白腐菌對(duì)水葫蘆的降解預(yù)處理對(duì)產(chǎn)氣特性的影響

經(jīng)白腐菌處理10 d、15 d后，水葫蘆中難降解的木質(zhì)素、纖維素等均有所降解，從而提高了發(fā)酵材料的利用率。采用相關(guān)分析，單位TS產(chǎn)氣量與木質(zhì)素含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.957*，P＜0.05)，與纖維素含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.906*，P＜0.05)，與半纖維素含量相關(guān)性不顯著(r=－0.724，P＞0.05)。而經(jīng)白腐菌預(yù)處理25 d，木質(zhì)素、纖維素雖然進(jìn)一步降解，但單位TS產(chǎn)氣量反而降低，可能是白腐菌預(yù)處理的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微生物本身生理活動(dòng)消耗了一定的產(chǎn)沼氣底物。因此，生產(chǎn)上要控制合適的預(yù)處理時(shí)間。

對(duì)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中各處理組和對(duì)照組的甲烷含量做統(tǒng)計(jì)分析，由黃孢原毛平革菌和糙皮側(cè)耳預(yù)處理10 d、15 d、25 d的甲烷含量與對(duì)照組的甲烷含量無(wú)顯著性差異;將木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量分別與平均甲烷含量做相關(guān)分析可知，平均甲烷含量與木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量相關(guān)性均不顯著。推測(cè)，白腐菌的降解處理對(duì)甲烷含量沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。

對(duì)于單位TS甲烷產(chǎn)量，兩菌分別處理10 d、15 d單位TS甲烷產(chǎn)量較對(duì)照組均有顯著提高，而處理25 d后，黃孢原毛平革菌和糙皮側(cè)耳兩組單位TS甲烷產(chǎn)量較對(duì)照顯著降低。說(shuō)明用黃孢原毛平革菌或糙皮側(cè)耳對(duì)水葫蘆進(jìn)行降解處理后，用于厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣是可行的，但預(yù)處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，生產(chǎn)上要控制合適的預(yù)處理時(shí)間。

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