殷 帥，徐仁芳，何小舟，徐海燕

（蘇州大學第三附屬醫(yī)院、常州市第一人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇 常州 213001）

miRNA是一類大小為21～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，miRNA在發(fā)育、衰老、腫瘤發(fā)生等病理生理過程的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，miRNA通過靶向不同的目的mRNA，在不同程度上調(diào)節(jié)蛋白表達水平，進而在生物的生長發(fā)育中起重要作用[1]。 新近研究表明，miR-34s（miR-34 家族）在抗癌基因p53的調(diào)控通路中發(fā)揮著不可忽視的作用[2-10]。miR-34s的轉(zhuǎn)錄受 p53蛋白調(diào)節(jié)，并參與p53 作用通路[3-10]；此外，miR-34s 還通過對 SIRT I和E2F3的抑制進而對p53活性產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)作用[2，11－12]；其中，miR-34a 和 miR-34b/c 的編 碼基 因為p53目的基因并且擁有腫瘤抑制功能，如誘發(fā)細胞凋亡、細胞周期阻滯、促進細胞衰老等，同時miR-34a和miR-34b/c基因啟動子序列區(qū)存在一個CpG島，在一些腫瘤如結腸癌、乳腺癌、胰腺癌等，該CpG島被甲基化后導致miR-34a和miR-34b/c的失活并伴隨著p53的突變及功能的抑制[13-14]。本研究觀察腎透明細胞癌組織中miR-34a和miR-34b/c基因CpG島的甲基化水平，旨在為探討miR-34a和miR-34b/c在腎癌中的生物學功能及其與腫瘤的關系提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選擇2008年1月至2012年7月在蘇州大學第三附屬醫(yī)院泌尿外科進行手術切除并保存于液氮中的30例腎癌組織標本及其癌旁正常組織 （癌旁正常組織距離腫瘤邊緣>5 cm）標本。其中男19例，女11例，年齡35～78歲，術后病理診斷均為腎透明細胞癌。依據(jù)是否伴有淋巴結轉(zhuǎn)移，將凍存的腎癌組織標本和癌旁正常組織標本分為2組：A組15例為無淋巴結和（或）遠處轉(zhuǎn)移標本，B組15例為有淋巴結和（或）遠處轉(zhuǎn)移標本。

1.2 主要試劑與儀器

Wizard基因組DNA純化試劑盒（美國Promega公司），EZ DNA甲基化試劑盒（德國 Zymo Research公司），常規(guī)試劑由常州市第一人民醫(yī)院泌尿外科實驗室提供。DU800紫外分光光度計（美國BECKMAN COULT ER 公司），ChemiDo cTM XRS+電泳照膠儀（美國BIORAD公司），EPPENDORF 6325型普通PCR儀（德國EPPENDORF公司），Himac CT15E低溫高速離心機（日本Hitachi公司）。

1.3 實驗方法

為了分析miR-34基因啟動子序列在腎透明細胞癌中的甲基化水平，本研究從收集的標本中分離提純基因組DNA（gDNA），并用重亞硫酸鹽處理（來源于甲基化試劑盒），從而使啟動子序列CpG島中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，同時將已甲基化的胞嘧啶保留下來。經(jīng)轉(zhuǎn)化后的gDNA用于甲基化型 PCR 分析[15]。

1.3.1 組織標本中DNA的提取

凍存組織標本經(jīng)碾碎后，使用Wizard DNA快速提取試劑盒提取、純化組織標本中的基因組DNA，DU800紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度，選取OD260/OD280吸光度比值位于1.6～1.8的樣本，詳細提取步驟可參閱產(chǎn)品說明書。

1.3.2 DNA的甲基化修飾

每份 200～500 ng的基因組 DNA（gDNA），經(jīng) EZ DNA甲基化試劑盒中的重亞硫酸鹽處理，最終可獲得 10 μL 甲基化修飾后的 DNA，每次取 1～2 μL 用于甲基化型 PCR（MSP）。

1.3.3 RT-PCR

取 1～2 μL甲基化修飾型 DNA進行 PCR，PCR的引物序列已經(jīng)是經(jīng)驗證過的[14]，序列見表1。

表1 PCR引物序列

PCR反應的條件：1）miR-34a反應溫度：95℃10 min，2 次循環(huán) 95 ℃ 20 s、68 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，2次循環(huán) 95 ℃ 20 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，34次循環(huán) 95 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min。2）miR-34b/c反應溫度：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s、68 ℃30 s、72℃ 30 s。PCR結果用4% 瓊脂糖膠上樣電泳，電泳照膠儀下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用 SPSS11.5統(tǒng)計軟件。本實驗采用χ2檢驗，分析miR-34s啟動子序列甲基化水平在腫瘤組織和正常組織中的差異以及與腎腫瘤淋巴結轉(zhuǎn)移的相關性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

甲基化型PCR電泳結果顯示，miRNA-34a和miR-34b/c基因成單一條帶，其所處的位置及其在正常組織和癌組織中的甲基化情況符合前期的預計（圖1-2），證明相應的試驗條件和所設計的引物均符合實驗要求。

PCR結果顯示，A組腎癌組織中miR-34a基因CpG 島甲基化 4例，占 26.7%（4/15），miR-34b/c 15例，占 100.0%（15/15），癌旁正常組織均為 0；B組腎癌組織中miR-34a基因CpG島甲基化13例，占86.7%（13/15），miR-34b/c 15 例，占 100.0%（15/15），癌旁正常組織均為0。結果表明，miR-34a和miR-34b/c基因CpG島甲基化狀態(tài)在腎癌組織中明顯增高；伴有淋巴結轉(zhuǎn)移的腎癌組織中，miR-34a基因CpG島甲基化明顯高于無淋巴結轉(zhuǎn)移的腎癌組織（86.7%比 26.7%，P<0.05）。 見表2。

圖1 miR-34/a電泳圖

圖1 miR-34b/c電泳圖

表2 miR-34a和miR-34b/c基因CpG島甲基化狀態(tài)比較

3 討論

目前，隨著對miRNA研究的深入，許多miRNA都顯示出其抑制腫瘤的能力，以miRNA作為治療腫瘤的新型基因藥物也成為目前的熱點。在本次實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌組織中miR-34a和miR-34b/c基因啟動子CpG島均存在較高的甲基化水平，而基因啟動子的甲基化狀態(tài)的改變，促使miR-34a和miR-34b/c基因沉默，引起腎透明細胞癌低表達miR-34a和miR-34b/c，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、演變具有一定的聯(lián)系。

新近研究表明，miR-34a和miR-34b/c具腫瘤抑制作用，不僅通過參與p53通路對腫瘤的抑制，而且也直接有抑制腫瘤的作用，如：1）細胞周期阻滯。Tarasov等[16]將miR-34a全長轉(zhuǎn)錄體導入骨肉瘤細胞U-2OS 48 h后，發(fā)現(xiàn)導入細胞組相對對照組停滯在G1期的細胞數(shù)目增加,同時伴隨S期細胞的減少,說明miR-34a可使細胞周期阻滯在G1期。 2）促進細胞衰老。 Tazawa 等[12]將 miR-34a 轉(zhuǎn)染入HCT116細胞、RKO細胞和p53突變的SW480細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞體積增大且衰老，表明miR-34a可以誘發(fā)細胞衰老。3）誘導細胞調(diào)亡。miR-34s在癌細胞中重新激活可促使caspase3和PARP的裂解,誘發(fā)caspase調(diào)控的凋亡途徑[4,6,12]。 4）阻止細胞遷移。在黑色素瘤和肝癌組織中，miR-34的再活化能夠抑制c-Met蛋白，阻止腫瘤細胞的遷移和浸潤[17]。

檢測釋放到體液中的啟動子CpG島甲基化型miR-34a和miR-34b/c，有可能成為一種新的腫瘤診斷標記，這在其他基因診斷中已被證實，如GSTP[18]。最近研究表明，應用miR-34a治療腫瘤的小鼠模型，可完全抑制腫瘤的生長[19]。因此，基于miR-34啟動子甲基化的診斷和miR-34治療的結合是可行的。如何采用特定而有效的方法來檢測miR-34啟動子的甲基化及運用miR-34治療腫瘤，作為泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷的指標、治療的手段或靶點有可能成為從根本上防治這些疾病的一個新的突破口。

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