李瑞華，劉 亮，聶大平，曲 杰

細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因主要有qnrA、qnrS、qnrB、qnrC、qnrD、aac（6’）－1b－cr、qepA 和oqxAB，其中qepA和oqxAB是近年來新發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)耐喹諾酮類藥物的外排泵轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因［1］。oqxAB 基因是由丹麥科學(xué)家Sorensen等［2］在2003年從豬糞中分離的1株含有可接合質(zhì)粒的pOLA52的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)的，將pOLA52質(zhì)粒在異源性大腸埃希菌中特異表達，可使其對萘啶酸和環(huán)丙沙星的最低抑菌濃度（MIC）分別提高800%和1 600%。現(xiàn)已在動物和人的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和沙門菌都檢測到oqxAB基因［3－5］。

本研究對臨床分離的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌進行oqxAB基因檢測，并通過質(zhì)粒接合試驗了解oqxAB基因的傳播機制，為臨床減少oqxAB基因流行和合理用藥提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

（一）菌株 收集2012年9—11月分離自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院患者血、尿、分泌物、痰標(biāo)本的121株細(xì)菌。均為患者的初次分離菌株，其中大腸埃希菌72株，肺炎克雷伯菌49株。oqxAB基因陽性對照菌為肺炎克雷伯菌ATCC700603、受體菌大腸埃希菌、大腸埃希菌ATCC25922。

（二）主要試劑及儀器 引物合成和Marker DL2000TM購自大連寶生物工程有限公司。PCR Mastermix購自天根生化科技有限公司。西班牙瓊脂糖購于北京方寶生物技術(shù)公司。LB、MH培養(yǎng)基、胰大豆瓊脂為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。ZF－302型紫外線分析儀為上海梅穎浦儀器儀表公司產(chǎn)品。

（三）細(xì)菌鑒定與藥敏試驗 細(xì)菌鑒定及藥敏由VITEK2細(xì)菌鑒定藥敏分析儀完成，大腸埃希菌ATCC25922作為藥敏試驗質(zhì)控菌。藥敏試驗結(jié)果按照CLSI 2012年版標(biāo)準(zhǔn)判讀。

二、方法

（一）PCR擴增oqxAB基因

1.煮沸法提取細(xì)菌DNA：挑取過夜培養(yǎng)純菌落于1 mL生理鹽水調(diào)成5麥?zhǔn)蠞岫龋?3 000 r／min離心10 min，棄上清液。加入200μL滅菌蒸餾水，混勻后煮沸10 min，13 000 r／min離心10 min，吸取上清液，－20℃冷凍，備用。

2.PCR引物及反應(yīng)條件：oqxAB基因引物序列參照文獻［4］，反應(yīng)體系為25μL：PCR反應(yīng)液12.5μL、上下游引物各1μL、細(xì)菌 DNA（模板）2.0μL、滅菌蒸餾水補足至25μL。

PCR反應(yīng)條件 oqxA：94℃3 min，94℃45 s→57℃45 s→68℃ 60 s，34個循環(huán)，68 ℃延伸7 min。oqxB：94℃3 min，94℃45 s→64℃45 s→72℃60 s，32個循環(huán)，72℃延伸7 min。

3.電泳：取5μL PCR產(chǎn)物，在含有溴乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線分析儀下觀察，拍照。將392 bp（oqxA）、512 bp（oqxB）擴增條帶與肺炎克雷伯菌ATCC700603比較，并將PCR產(chǎn)物純化后送往大連寶生物工程有限公司進行測序，結(jié)果在GenBank比對。

（二）質(zhì)粒接合實驗 選oqxA及oqxB基因均陽性的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌為供體菌。受體菌為大腸埃希菌。方法：取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的供體菌及受體菌各0.5 mL加到4 mL新鮮LB肉湯中過夜培養(yǎng)。接合子分別以原液、10、100、1 000、10 000倍稀釋接種于含疊氮鈉（100 mg／L）、慶大霉素（10 mg／L）的胰大豆瓊脂（TSA）平皿篩選，并將接合子傳代3次。

（三）瓊脂稀釋法測環(huán)丙沙星對大腸埃希菌接合子和8株含與不含oqxAB基因環(huán)丙沙星敏感肺炎克雷伯菌的MIC及MPC用瓊脂稀釋法測定環(huán)丙沙星對oqxAB基因陽性的供體菌、接合子、大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌J53及肺炎克雷伯菌的MIC。防耐藥突變濃度（MPC）是將上述細(xì)菌濃度調(diào)到10麥?zhǔn)蠞舛龋?.1 mL涂布含不同濃度環(huán)丙沙星平皿，37℃孵育48 h后無菌落生長的平皿所含藥物濃度為該菌的MPC。

（四）統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用χ2檢驗比較oqxAB基因在環(huán)丙沙星敏感和耐藥菌中檢出率。

結(jié) 果

一、OqxAB基因陽性菌株

72株大腸埃希菌分別檢測出oqxA基因15株（20.8%），oqxB 基因4株（5.6%），oqxAB基因7株（9.7%）；49株肺炎克雷伯菌分別檢測出oqxA基因4株（8.2%），oqxB 基因1株（2.0%），oqxAB 基因34株（69.4%）。測序結(jié)果顯示，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌與GenBank登錄號為AB601773.1和FJ975561.1的oqxAB基因序列相似度均為99%。

二、oqxAB陽性菌株在環(huán)丙沙星敏感和耐藥大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中分布

在環(huán)丙沙星敏感和耐藥的大腸埃希菌中oqxˉAB 基因陽性分別為2株（2／16）和5株（5／56）（χ2＝0.003，P＞0.90）；在環(huán)丙沙星敏感和耐藥肺炎克雷伯菌中，oqxAB基因陽性分別為8株（8／14）和26株（26／35）（χ2＝0.69，P＞0.25）。表明，oqxAB 基因在環(huán)丙沙星敏感和耐藥的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

三、含與不含oqxAB基因大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌藥敏結(jié)果。

含與不含oqxAB基因大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對喹諾酮類藥物敏感率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但含oqxAB基因的肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類抗生素敏感率低于不含oqxAB基因的菌株。見表1。

表1 含與不含oqxAB基因大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的敏感率（%）Table 1 The susceptibilities of E.coli and K.pnuemoniae strains with or without oqxABto antimicrobial agents（%）

四、質(zhì)粒接合試驗及接合子MIC和MPC

將5株含有oqxAB基因的大腸埃希菌進行質(zhì)粒接合試驗，有4株生長，挑選出可能為接合子的單菌落，PCR擴增oqxAB、4株菌均擴增出oqxAB基因，4株接合子環(huán)丙沙星的MIC和MPC值較受體菌分別高15～31倍和32倍。見表2。

經(jīng)3次傳代，細(xì)菌中仍然能檢測出oqxAB基因，說明oqxAB在大腸接合子中的存在比較穩(wěn)定。

肺炎克雷伯菌未接合成功。環(huán)丙沙星MIC在≤0.062 5 mg／L 時，含和不含oqxAB 基因肺炎克雷伯菌各4株的 MPC為0.25～1.0mg／L；環(huán)丙沙星 MIC為0.25～0.5 mg／L時，含和不含oqxAB基因肺炎克雷伯菌各4株的MPC為2～16 mg／L。

表2 大腸埃希菌oqxAB基因供體菌、受體菌及接合子對環(huán)丙沙星的MIC和MPC值（mg／L）Table 2 The MICs and MPCs of ciprofloxacin against donor，recipient and transconjugant of oqxAB－positive E.coli（mg／L）

討 論

本研究肺炎克雷伯菌oqxAB基因陽性率為69.4%。大腸埃希菌為9.7%、但oqxA基因單獨檢出率在大腸埃希菌較高。而上海地區(qū)肺炎克雷伯菌oqxAB基因陽性率為100%，大腸埃希菌為6.6%［6］；韓國來源血培養(yǎng)的261株大腸埃希菌、65株陰溝腸桿菌和135株肺炎克雷伯菌oqxAB基因陽性率分別為0.4%、4.6%和74.1%［4］。檢出率不同可能是由于各個國家、地區(qū)使用抗菌藥物的習(xí)慣不同所致。

研究證明大腸埃希菌oqxAB基因存在于質(zhì)粒中，qnr、qepA和oqxAB基因本身賦予喹諾酮類的耐藥是低水平的，即MIC值仍在敏感范圍內(nèi)，但與不含上述基因菌株比較，其MIC值可升高2～256倍［1，3，6］，本研究質(zhì)粒接合試驗在大腸埃希菌有4株細(xì)菌質(zhì)粒接合成功，傳3代后，PCR可測出oqxAB基因，說明oqxAB性基因可通過質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)移并且比較穩(wěn)定。比較環(huán)丙沙星對接合子、供體菌和大腸埃希菌J53的MIC，供體菌的耐藥水平高于其相對應(yīng)的接合子，4株接合子的MIC較受體菌升高15～31倍，但仍在敏感范圍內(nèi)。另外，研究結(jié)果顯示，oqxAB陽性基因在環(huán)丙沙星敏感和耐藥的菌株中分布沒有差異，而且含與不含oqxAB基因包括單純oqxA和oqxB基因的大腸埃希菌對喹諾酮類藥物敏感率沒有差別。這些都表明oqxAB基因介導(dǎo)喹諾酮耐藥是低水平的。我們檢測含oqxAB基因接合子的MPC，發(fā)現(xiàn)其MPC較受體菌大腸埃希菌J53明顯增高，證明含oqxAB基因的細(xì)菌在喹諾酮類藥物壓力選擇下也能導(dǎo)致高水平耐藥。

本研究中肺炎克雷伯菌質(zhì)粒接合沒有成功，含與不含oqxAB基因的菌株對喹諾酮藥物敏感率沒有差別，但含oqxAB基因的菌株對氨基糖苷類抗生素敏感率低于不含oqxAB基因的菌株。有研究表明，肺炎克雷伯菌oqxAB基因存在染色體或大質(zhì)粒上，oqxAB基因在臨床分離株中有低表達（MIC≤0.06 mg／L）和高表達（MIC≥0.125 mg／L），RTPCR顯示，oqxA高表達時是低表達的4倍；肺炎克雷伯菌ATCC700603中oqxA的表達是肺炎克雷伯菌ATCC27799的18倍［7］。表明肺炎克雷伯菌對喹諾酮類的敏感程度取決于oqxAB的表達水平。Yuan等［6］發(fā)現(xiàn)部分含oqxAB基因肺炎克雷伯菌，環(huán)丙沙星 MIC≤0.03 mg／L，提示oqxAB基因沒有表達。為了解不同MIC值的菌在喹諾酮壓力下是否能產(chǎn)生高水平耐藥，我們測定環(huán)丙沙星 MIC≤0.062 5 mg／L肺炎克雷伯菌的 MPC，發(fā)現(xiàn)有或無oqxAB基因，都未產(chǎn)生高水平耐藥，而環(huán)丙沙星MIC為0.25～0.5 mg／L，有或無oqxAB 基因的肺炎克雷伯菌均產(chǎn)生高水平耐藥。表明oqxAB基因沒有受到喹諾酮壓力選擇，高水平耐藥僅與其MIC濃度相關(guān)，這有待于進一步研究。

綜上所述，在大腸埃希菌中oqxAB基因是由質(zhì)粒介導(dǎo)的，對喹諾酮類抗菌藥物產(chǎn)生低水平耐藥，含oqxAB基因細(xì)菌在環(huán)丙沙星壓力選擇下能產(chǎn)生高水平耐藥。oqxAB基因廣泛存在于肺炎克雷伯菌中，對環(huán)丙沙星敏感的肺炎克雷伯菌，在環(huán)丙沙星壓力選擇下產(chǎn)生高水平耐藥似乎與oqxAB基因無關(guān)，而與其MIC濃度有關(guān)。

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