蘇家樂(lè)，李 暢，劉曉青，陳尚平，何麗斯

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江蘇 南京 210014)

一品紅(Euphorbia pulcherrima Willd.)為大戟科(Euphorbiaceae)大戟屬(Euphorbia)多年生草本植物，品種數(shù)以百計(jì)。至今，市場(chǎng)上一品紅品種均系國(guó)外進(jìn)口，缺乏品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，而中國(guó)自主選育品種極少且未見(jiàn)大面積應(yīng)用推廣，這無(wú)疑成為制約中國(guó)一品紅產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸［1-4］。目前國(guó)內(nèi)對(duì)一品紅的研究多集中在栽培領(lǐng)域，有性繁殖研究很少［2-7］。雜交育種是一品紅良種選育的有效途徑，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)授粉是植物雜交育種成功的基礎(chǔ)，故開(kāi)展花發(fā)育、柱頭可授性等的研究，可提高中國(guó)一品紅雜交育種效率，對(duì)選育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一品紅新品種具一定的指導(dǎo)意義。

柱頭可授期是花朵成熟過(guò)程中一個(gè)重要時(shí)期，對(duì)其單花的開(kāi)花動(dòng)態(tài)的了解是進(jìn)一步研究柱頭可授性的基礎(chǔ)［8］。諸多植物已證實(shí)柱頭可授性與花發(fā)育及其形態(tài)變化具有密切聯(lián)系:柱頭不同形態(tài)時(shí)期的可授性存在差異，如與一品紅一樣具有2裂片柱頭的百日草［9］、美洲狼尾草［10］、核桃［11］等，在花發(fā)育過(guò)程中柱頭裂片開(kāi)張擴(kuò)展到達(dá)一定形狀，如Y形、倒八形，可授性達(dá)到最佳;又如刺五加［12］、楊樹(shù)［13］、大葉相思［14］等柱頭在性成熟時(shí)會(huì)分泌黏液，百日草［9］、耬斗菜［15］、月季［16］等則出現(xiàn)大小均勻的乳突細(xì)胞。通過(guò)花朵開(kāi)發(fā)度［14，17］、柱頭顏色［18-19］、形態(tài)［9-11，16］以及柱頭分泌物［12-14］等可確定最佳授粉時(shí)期，而在一品紅上尚未見(jiàn)此方面報(bào)道。本研究以一品紅市場(chǎng)主栽品種千禧為試驗(yàn)材料，對(duì)其雌花發(fā)育特性和不同發(fā)育形態(tài)柱頭可授性進(jìn)行研究，試圖明確雌花柱頭發(fā)育形態(tài)與可授性的關(guān)系，以期為一品紅的雜交育種及生殖機(jī)理研究提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所荷蘭Venlo型現(xiàn)代化玻璃溫室中一品紅品種千禧1年生成齡植株。

1.2 方法

1.2.1 雌花、柱頭發(fā)育特性觀察 蕾期選取雌花發(fā)育基本一致的杯狀花序30個(gè)，每天觀察記錄雌花開(kāi)放形態(tài)及其變化情況。切取不同開(kāi)放階段的雌花柱頭，2.5%戊二醛固定，經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)沖洗、乙醇梯度脫水、醋酸異戊酯置換、臨界點(diǎn)干燥、粘樣和噴金后，置于Hitachi S-3000N電子掃描顯微鏡(Scanning electron microscopy，SEM)下觀察柱頭表面。

1.2.2 柱頭可授性藥劑檢測(cè) 采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法［20］進(jìn)行柱頭可授性藥劑檢測(cè):在方法1.2.1試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，于11∶00選取一品紅品種千禧不同柱頭形態(tài)的雌花，將其柱頭切下后迅速浸入含有聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)液(1%聯(lián)苯胺∶3%過(guò)氧化氫∶水=4∶11∶22，體積比)凹面載玻片的凹陷處，體式顯微鏡(Olympus SZX10)下觀察柱頭開(kāi)始發(fā)生顏色變化和產(chǎn)生氣泡的時(shí)間，觀察5 min內(nèi)柱頭顏色變化和柱頭表面產(chǎn)生氣泡的數(shù)量，每時(shí)期30朵花，重復(fù)3次。

1.2.3 柱頭可授性人工授粉檢測(cè) 選取一品紅品種千禧不同發(fā)育形態(tài)階段的柱頭(雌花)，于晴天11∶00采取新鮮花粉進(jìn)行人工授粉，授粉6 h后取下雌花，F(xiàn)AA固定(70%酒精∶冰醋酸∶福爾馬林=90∶5∶5)后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。常溫下，切取固?4 h以上的雌花柱頭，1 mol/L NaOH軟化脫色8 h后，蒸餾水清洗3次后將樣品置于載玻片上，0.01%苯胺藍(lán)溶液(0.1 mol/L K3PO4+18%甘油)壓片，5 min后在熒光顯微鏡(Olympus BX51)下觀察柱頭上的花粉萌發(fā)情況并拍照。由于樣品在熒光顯微鏡觀察之前，經(jīng)FAA固定、NaOH處理及蒸餾水清洗等過(guò)程，若花粉沒(méi)有在柱頭萌發(fā)，那么簡(jiǎn)單附著在柱頭的花粉將會(huì)被洗掉，因此最終在柱頭上觀察的花粉可視為萌發(fā)，這部分花粉有的可以看到花粉管，有的看不到花粉管是因?yàn)樵囼?yàn)技術(shù)本身所致［21］。每時(shí)期觀察雌花30個(gè)，記錄每個(gè)柱頭上的花粉粒數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 雌花發(fā)育特性

一品紅雌花無(wú)花被，花柱3、基部合生，柱頭2裂，子房柄明顯伸出杯狀花序總苞外。因雌花無(wú)花被，其雌花發(fā)育特性皆以花柱柱頭的發(fā)育進(jìn)程界定，根據(jù)外部形態(tài)變化，一品紅雌花發(fā)育進(jìn)程可分為顯花期、初開(kāi)期、Y字期、八字期和翻卷期5個(gè)時(shí)期(圖1)。以其中1個(gè)花柱柱頭進(jìn)行描述，顯花期柱頭柱狀，2裂片未分開(kāi)，該時(shí)期持續(xù)3～4 d，柱狀花柱由杯狀花序總苞伸出逐漸伸長(zhǎng)至最長(zhǎng)(圖1A1、圖1A2);初開(kāi)期，柱頭略開(kāi)展，2裂片微張，夾角≤15°，持續(xù)1～2 d(圖1B1、圖1B2);Y字期，柱頭前端裂片張開(kāi)呈Y字型，柱頭2裂片夾角15°至45°持續(xù)1～2 d，SEM下柱頭表面未見(jiàn)乳突，開(kāi)始出現(xiàn)少量滲出物(圖1C1、圖1C2和圖2A);八字期2裂片呈倒八字型，始于2裂片尖端向下彎曲，卷曲度不超過(guò)半圈，即柱頭2裂片夾角45°至120°之間，可持續(xù)3～5 d，SEM下柱頭表面細(xì)胞平展，濕型滲出物大量可見(jiàn)(圖1D1、圖1D2、圖2B和圖2C);翻卷期，柱頭2裂片向外、向下翻卷，柱頭逐漸萎蔫干枯(圖1E1和圖1E2)。子房無(wú)論授粉與否均在八字期開(kāi)始膨大并逐漸伸出總苞，翻卷期后子房未繼續(xù)膨大的雌花逐漸干枯，與子房柄一同脫落。

圖1 一品紅雌花發(fā)育進(jìn)程Fig.1 Pistillate flower development process of Euphorbia pulcherrima

圖2 一品紅柱頭掃描電鏡觀察Fig.2 The stigma of Euphorbia pulcherrima viewed with a scanning electronic microscope

2.2 柱頭可授性藥劑檢測(cè)情況

若雌花柱頭具有可授性，經(jīng)聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫染色的柱頭組織會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色并伴有大量氣泡產(chǎn)生，根據(jù)柱頭染色的面積、深淺和氣泡數(shù)量可確定其柱頭可授性的強(qiáng)弱［11］。如表1所示，一品紅柱頭可授性與雌花、柱頭發(fā)育密切相關(guān):雌花顯花期柱頭柱狀、裂片未開(kāi)張，不具有可授性;初開(kāi)期到八字期，隨著柱頭裂片開(kāi)張角度逐漸增大，柱頭可授性逐漸增加;雌花八字期可授性最強(qiáng)，其柱頭表面觸突細(xì)胞伸展、光亮，有滲出物產(chǎn)生，藥檢表現(xiàn)為柱頭變色快、藍(lán)色著色深，柱頭周圍氣泡多且產(chǎn)生最為迅速，著色部位主要集中在柱頭裂片中下部和花柱底部切口處;翻卷期染色不明顯，可授性在該時(shí)期前期(1～3 d)極弱，后期柱頭干枯不具可授性。

2.3 花粉在不同發(fā)育時(shí)期柱頭上萌發(fā)情況

對(duì)一品紅雌花柱頭不同發(fā)育階段進(jìn)行授粉試驗(yàn)，結(jié)果表明柱頭粘附花粉的數(shù)量存在差異(表1、圖3)。顯花期柱頭裂片未開(kāi)張，無(wú)花粉粘附萌發(fā)。進(jìn)入初開(kāi)期，柱頭上開(kāi)始有個(gè)別花粉粘附，且隨著柱頭裂片開(kāi)張度的逐漸加大，在柱頭上粘附萌發(fā)的花粉數(shù)量逐漸增加(圖3A)，至八字期(圖3B和圖3C)，粘附的花粉數(shù)量達(dá)到最多，翻卷期柱頭進(jìn)入衰老時(shí)期，顯見(jiàn)花粉粘附。說(shuō)明柱頭從初開(kāi)期便具有可授性，隨后柱頭可授性逐漸增加，到達(dá)八字期時(shí)可授性最強(qiáng)。

表1 一品紅品種千禧雌花不同發(fā)育時(shí)期柱頭可授性藥劑檢測(cè)Table 1 Detection for stigma receptivity at different development periods of pistillate flower of E.pulcherrim cultivar Millenium

圖3 一品紅柱頭可授性Fig.3 Stigma receptivity of Euphorbia pulcherrima

3 討論

花部特征及其發(fā)育特性對(duì)植物的成功繁殖具有重要影響［22］。一品紅雌花無(wú)花被，雌花開(kāi)放動(dòng)態(tài)亦可視為柱頭發(fā)育，與核桃［11］、百日草［9］、狼尾草［10］、膏桐［23］等柱頭形態(tài)發(fā)育相似，一品紅在成熟衰老過(guò)程中表現(xiàn)出典型的形態(tài)特征:杯狀花序中居中著生的雌花，經(jīng)歷顯花期、初開(kāi)期、Y字期、八字期和翻卷期，其對(duì)應(yīng)的柱頭外部形態(tài)發(fā)育表現(xiàn)為逐漸伸長(zhǎng)柱狀—小V狀—Y狀—八狀—羊角狀干枯，柱頭可授性也從無(wú)到柱頭裂片初開(kāi)張的雌花初開(kāi)期較弱、逐漸增強(qiáng)至雌花八字期達(dá)到最強(qiáng)，最后喪失。一品紅柱頭電鏡掃描顯示，與核桃［11］、楊樹(shù)［13］等一樣，一品紅為濕柱頭，柱頭表面滲出物亦隨柱頭的發(fā)育由無(wú)到出現(xiàn)，至八字期達(dá)到最多，而此時(shí)柱頭可授性亦最強(qiáng)。說(shuō)明一品紅同諸多植物［9-19］一樣，雌花、柱頭形態(tài)發(fā)育特征與柱頭可授性具有較強(qiáng)的相關(guān)性，可通過(guò)雌花、柱頭形態(tài)發(fā)育特征來(lái)確認(rèn)柱頭授粉時(shí)期。此外，在觀察中還發(fā)現(xiàn)無(wú)論受精成功與否，一品紅子房均從八字期始出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，因此子房膨大不能作為受精成功的判斷，這與核桃［11］的報(bào)道一致。

柱頭可授性是有性生殖的最主要環(huán)節(jié)之一，掌握一品紅的柱頭可授期及不同發(fā)育時(shí)期的可授性強(qiáng)弱，可有效提高一品紅雜交育種的成功率。研究結(jié)果表明柱頭2裂片從開(kāi)始開(kāi)張到八字期均具有可授性，一般持續(xù)6～8 d，持續(xù)晴朗高溫天氣可加速花發(fā)育使可授期縮短;雌花八字期為最佳授粉時(shí)期，這可能與柱頭表面滲出物多、表面積大有關(guān)［16］，該時(shí)期始于柱頭2裂片開(kāi)張的第3～4 d、可持續(xù)3～5 d，肉眼可通過(guò)柱頭倒八字狀(柱頭2裂片向外彎曲，開(kāi)張角度為45°至120°)、柱頭表面光亮(圖1D1和圖1D2)來(lái)判斷。雜交育種中，建議在八字期重復(fù)授粉以提高授粉成功率。聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫染色法檢測(cè)一品紅柱頭可授性的結(jié)果與人工授粉顯微觀察基本吻合，可作為一品紅柱頭可授性以及最佳授粉時(shí)期判別的快速檢測(cè)方法。此外，在柱頭可授性檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)柱頭裂片表面不同部位染色及花粉粘著情況存在差異，具體原因尚需進(jìn)一步細(xì)化研究。

［1］李 暢，蘇家樂(lè)，陶 俊.現(xiàn)代溫室一品紅高效栽培技術(shù)及效益分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(6):273-275.

［2］黃子峰，王鳳蘭，周厚高，等.一品紅盆花新品種“閃亮”［J］.園藝學(xué)報(bào)，2011，38(12):2423-2424.

［3］黃子峰，周厚高，王鳳蘭，等.一品紅盆花新品種“紅荷”［J］.園藝學(xué)報(bào)，2012，39(1):199-200.

［4］陳 璐，李 暢，蘇家樂(lè)，等.一品紅"檸檬雪"莖段組織培養(yǎng)快繁技術(shù)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(6):50-52.

［5］李 暢，蘇家樂(lè)，劉曉青，等.一品紅不同品種葉片葉綠素?zé)晒馓匦员容^［J］.園藝學(xué)報(bào)，2009，36(10):1519-1524.

［6］孫向麗，張啟翔.溫室盆栽一品紅水肥耦合效應(yīng)研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(3):99-105.

［7］孫向麗，張啟翔.一品紅生物量及對(duì)水分、養(yǎng)分吸收利用的變化規(guī)律［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(6):1191-1200.

［8］DAFNI A.Pollination ecology:A practical approach［M］.New York:Oxford University Press，1992.

［9］葉要妹，張俊衛(wèi)，齊迎春，等.百日草柱頭可授性和花粉生活力的研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(10):2376-2381.

［10］穆少杰，鐘小仙，顧洪如，等.美洲狼尾草柱頭可授性和象草花粉活力的研究［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2010，32(2):37-41.

［11］劉 昊，高 英，董寧光，等.核桃優(yōu)良品種雌雄花授粉活力的研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(6):119-123.

［12］劉林德，張洪軍，祝 寧，等.刺五加花粉活力和柱頭可授性的研究［J］.植物研究，2001，21(3):375-380.

［13］李艷華，康向陽(yáng).白楊派樹(shù)種雌蕊柱頭可授性及其檢測(cè)方法的研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2007，27(5):859-863.

［14］李 軍，黃烈健，陳祖旭，等.大葉相思花部形態(tài)與開(kāi)花生物學(xué)研究［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2010，18(4):379-385.

［15］朱蕊蕊，明 曉，高亦珂，等.耬斗菜(Aquilegia viridiflora)開(kāi)花生物學(xué)特性初步研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19(5):162-166.

［16］王其剛，張 顥，蹇洪英，等.月季柱頭形態(tài)發(fā)育進(jìn)程與可授性［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21(5):169-173.

［17］關(guān)文靈，李葉芳，陳 賢，等.蝴蝶花花器結(jié)構(gòu)和開(kāi)花授粉生物學(xué)特性［J］.園藝學(xué)報(bào)，2009，36(10):1485-1490.

［18］劉林德，張 萍，張 麗，等.錦帶花的花粉活力、柱頭可授性及傳粉者的觀察［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2004，24(8):1431-1434.

［19］齊秀娟，張紹鈴，方金豹.全紅型軟棗獼猴桃花器結(jié)構(gòu)和開(kāi)花授粉生物學(xué)特性［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2011，31(5):966-971.

［20］DAFNI A，MAUéS M M.A rapid and simple procedure to determine stigma receptivity ［J］.Sexual Plant Reproduction，1998，11:177-180.

［21］孫春青，陳發(fā)棣，房偉民，等.栽培菊花‘奧運(yùn)天使’與野路菊雜交生殖障礙的細(xì)胞學(xué)機(jī)理［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(6):2085-2091.

［22］張大勇.植物生活史進(jìn)化和繁育生態(tài)學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2004.

［23］羅長(zhǎng)維，李 昆，陳 友，等.膏桐花粉活力與柱頭可授性及其生殖特性研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2007，27(10):1994-2001.