劉建福，鐘書(shū)淳，王奇志，王明元，唐源江，楊 晨

(華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系，福建 廈門(mén) 361021)

一氧化氮(Nitric oxide，NO)作為一種新的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)信號(hào)分子，廣泛存在于植物組織中，并參與植物呼吸作用、光形態(tài)建成、種子萌發(fā)、衰老、逆境響應(yīng)、細(xì)胞程序性死亡以及抗病防御反應(yīng)等過(guò)程［1-3］。作為防御響應(yīng)中的關(guān)鍵信使，NO在緩解種子萌發(fā)過(guò)程中的鹽脅迫［4-8］、水分脅迫［9］、滲透脅迫［10-11］和重金屬脅迫［12］等非生物脅迫中起到重要作用。NO作為信號(hào)分子在植物抗逆性中的作用越來(lái)越受到重視，而外源NO對(duì)龍眼的種子萌發(fā)及其生理效應(yīng)的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)研究不同pH模擬酸雨對(duì)龍眼種子萌發(fā)的影響，以及在pH 3.5酸雨脅迫下外源NO供體硝普鈉(SNP)對(duì)龍眼種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和生理特性的影響，為NO應(yīng)用于龍眼的抗酸雨研究提供科學(xué)依據(jù)，以及為耐酸雨植物的引種馴化種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2012年9月挑取籽粒飽滿、大小一致和無(wú)病蟲(chóng)害的“福眼”龍眼果實(shí)，剝殼去肉，得到種子，用清水漂洗，以0.3%H2O2消毒10 min，并用去離子水沖洗數(shù)次。晾干備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 酸雨脅迫下龍眼種子萌發(fā)試驗(yàn) 按SO2-4∶NO3-=5∶1體積比配制酸雨母液［13］，酸雨脅迫程度分別設(shè)計(jì)為 pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0、pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5和 pH 5.0，以 pH 6.5作為對(duì)照(CK)，共設(shè)8個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。種子置于塑料杯(高7.5 cm×直徑11.5 cm)中進(jìn)行發(fā)芽。塑料杯底部有3個(gè)直徑2～3 cm的排水孔，播種時(shí)先在塑料杯內(nèi)鋪上雙層紗布，裝入5 cm厚的干燥河沙，在每個(gè)塑料杯中放入20粒龍眼種子，再覆蓋1 cm厚的干燥河沙，然后每個(gè)處理加入25 ml不同 pH 值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 和6.5)模擬酸雨溶液，濕透塑料杯中的河沙，每杯為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理3杯，最后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光照時(shí)間為12 h/d，空氣濕度為85%～90%。每隔3 d各個(gè)處理澆灌25 ml不同pH值模擬酸雨溶液。

1.2.2 硝普鈉緩解酸雨脅迫下龍眼種子萌發(fā)試驗(yàn) 種子消毒后先分別用0 mmol/L(CK)、0.05 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L和1.00 mmol/L的硝普鈉(SNP)溶液于黑暗中浸泡4 d，每個(gè)處理20粒種子，共3個(gè)重復(fù)。將經(jīng)過(guò)SNP浸泡后的種子，播種于塑料杯的干燥河沙中，再用pH 3.5的模擬酸雨進(jìn)行澆灌，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d各個(gè)處理澆灌pH 3.5模擬酸雨溶液。

1.3 測(cè)定方法

每天觀察種子萌發(fā)情況，播種后5 d統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽勢(shì);播種后10 d統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù);發(fā)芽后11 d測(cè)量幼苗株高、鮮質(zhì)量、生根數(shù)和根長(zhǎng)度;發(fā)芽后20 d進(jìn)行根系丙二醛含量和根系活力測(cè)定。種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)以胚根突破種皮0.5 cm視為萌發(fā);發(fā)芽率=發(fā)芽的種子數(shù)/供試的種子總數(shù)×100%;發(fā)芽勢(shì)=前5 d正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;發(fā)芽指數(shù)(GI)=Σ Gt/Dt，Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)。用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量，用TTC法進(jìn)行根系活力的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003和DPS7.55軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，圖表數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝普鈉對(duì)酸雨脅迫下龍眼種子萌發(fā)的影響

由表1可以看出，模擬酸雨pH值為2.0～3.0時(shí)，龍眼種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均為0。模擬酸雨pH值為3.5～6.5時(shí)，隨著pH值的升高，龍眼種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。pH值為5.0時(shí)龍眼種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最大值，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照差異不顯著，發(fā)芽率顯著高于對(duì)照;可見(jiàn)pH 5.0模擬酸雨有利于龍眼種子的萌發(fā)。

在pH 3.5模擬酸雨下，硝普鈉能夠在一定程度上提高龍眼種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)(表2)。由表2可以看出，pH 3.5模擬酸雨條件下，龍眼種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均隨著硝普鈉濃度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì);硝普鈉濃度為0.25 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)分別比對(duì)照提高6.34倍、6.44倍和5.57倍;硝普鈉濃度為1.00 mmol/L時(shí)龍眼種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照差異不顯著。硝普鈉濃度為0.05～0.75 mmol/L時(shí)能夠緩解酸雨對(duì)龍眼種子的脅迫作用。說(shuō)明低濃度硝普鈉能夠緩解酸雨脅迫對(duì)龍眼種子的傷害，而高濃度硝普鈉的緩解作用較弱。可見(jiàn)，pH 3.5模擬酸雨顯著抑制龍眼種子的萌發(fā)，而低濃度硝普鈉能夠提高龍眼種子活力，緩解酸雨脅迫對(duì)龍眼種子萌發(fā)的抑制作用，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。

表1 模擬酸雨對(duì)龍眼種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of simulated acid rain on seed germination of Dimocarpus longan

表2 不同濃度硝普鈉對(duì)酸雨脅迫下龍眼種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different concentrations of sodium nitroprusside on seed germination of Dimocarpus longan under acid rain stress

2.2 硝普鈉對(duì)酸雨脅迫下龍眼幼苗生長(zhǎng)的影響

模擬酸雨pH值為2.0～3.0時(shí)，龍眼種子沒(méi)有萌發(fā)。由表3可以看出，模擬酸雨pH值為3.5～5.0時(shí)，隨著pH值的升高，龍眼幼苗的株高、鮮質(zhì)量、生根數(shù)和根長(zhǎng)均增加;pH 5.0時(shí)龍眼幼苗的株高、鮮質(zhì)量和根長(zhǎng)均達(dá)到最大值，并且顯著高于對(duì)照幼苗;pH 5.0時(shí)幼苗的生根數(shù)低于對(duì)照?？梢?jiàn)，酸雨脅迫對(duì)龍眼幼苗生長(zhǎng)的影響主要體現(xiàn)在根系的生長(zhǎng)，模擬酸雨pH 5.0有利于龍眼幼苗的生長(zhǎng)。

表3 模擬酸雨對(duì)龍眼幼苗生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of simulated acid rain on growth of Dimocarpus longan seedlings

由表4可以看出，pH 3.5酸雨脅迫下，龍眼幼苗株高隨著硝普鈉濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，硝普鈉濃度為0.25 mmol/L時(shí)，龍眼幼苗株高達(dá)到最大值。龍眼幼苗的鮮質(zhì)量、生根數(shù)和根長(zhǎng)均隨著硝普鈉濃度增加而下降，硝普鈉濃度為0.05 mmol/L和0.25 mmol/L時(shí)顯著高于對(duì)照和其他處理，0.05 mmol/L和0.25 mmol/L硝普鈉處理間的差異不顯著，而0.75 mmol/L和1.00 mmol/L硝普鈉處理與對(duì)照間的差異不顯著?？梢?jiàn)，低濃度硝普鈉(0.05 mmol/L和0.25 mmol/L)能顯著緩解酸雨脅迫促進(jìn)龍眼幼苗根部的生長(zhǎng)，提高幼苗的鮮質(zhì)量。

表4 不同濃度硝普鈉對(duì)酸雨脅迫下龍眼幼苗生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of different concentrations of sodium nitroprusside on growth of Dimocarpus longan seedlings under acid rain stress

2.3 硝普鈉對(duì)酸雨脅迫下龍眼幼苗根系活力的影響

根系直接影響著龍眼幼苗地上部分的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)吸收狀況。模擬酸雨pH值為2.0～3.5時(shí)，由于龍眼種子沒(méi)有萌發(fā)，沒(méi)有生成幼苗;模擬酸雨pH值為4.0～6.5時(shí)，根系活力隨著模擬酸雨pH值的升高而呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)(圖1)，其中pH 5.0時(shí)龍眼幼苗的根系活力達(dá)到最大值，其根系活力是對(duì)照的2.2倍?？梢?jiàn)，弱酸條件(pH 5.0)能夠提高根系活力，能促進(jìn)根系發(fā)育，增加根系水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而促進(jìn)幼苗地上部分的生長(zhǎng)。

根系影響幼苗吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，龍眼幼苗地上部分生長(zhǎng)的好壞很大程度上取決于根系的活力。從圖2可以看出，pH 3.5酸雨脅迫下，幼苗根系活力隨著硝普鈉濃度升高呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì);硝普鈉濃度為0.25 mmol/L時(shí)，根系活力達(dá)到了最大值?？梢?jiàn)，酸雨脅迫下，低濃度硝普鈉能夠提高龍眼幼苗根系活力，高濃度硝普鈉則抑制幼苗根系活力。

圖1 模擬酸雨對(duì)龍眼幼苗根系活力的影響Fig.1 Effects of simulated acid rain stress on root activity in longan seedlings

圖2 酸雨脅迫下硝普鈉對(duì)龍眼幼苗根系活力的影響Fig.2 Effects of sodiumn nitroprusside on root activity in longan seedlings under acid rain stress

2.4 硝普鈉對(duì)酸雨脅迫下龍眼幼苗丙二醛含量的影響

模擬酸雨pH值為2.0～3.0時(shí)，種子沒(méi)有萌發(fā)，沒(méi)有生成幼苗;模擬酸雨pH值為3.5～6.5時(shí)龍眼幼苗根部丙二醛含量的變化見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，模擬酸雨pH值為4.0和4.5時(shí)，龍眼幼苗根部的丙二醛含量分別比對(duì)照(pH 6.5)分別提高37.75%和36.64%，說(shuō)明在酸性增加的條件下，根部中膜脂過(guò)氧化作用加強(qiáng)，根系的丙二醛含量增加;模擬酸雨pH值為5.0時(shí)，龍眼幼苗根部丙二醛的含量比對(duì)照降低了28.70%，說(shuō)明弱酸性條件有利于降低龍眼幼苗的膜脂過(guò)氧化作用。

pH 3.5酸雨脅迫下，不同濃度硝普鈉對(duì)龍眼幼苗丙二醛含量的影響見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，龍眼幼苗的丙二醛含量隨著硝普鈉濃度增加呈現(xiàn)出先降低后升高的變化;硝普鈉濃度為0.25 mmol/L時(shí)龍眼幼苗丙二醛含量降至最低值。但各處理的丙二醛含量值均較高，說(shuō)明pH 3.5的酸雨脅迫對(duì)龍眼幼苗的膜脂過(guò)氧化作用較強(qiáng)。低濃度硝普鈉(0.05 mmol/L和0.25 mmol/L)能夠降低龍眼幼苗的丙二醛含量，說(shuō)明低濃度硝普鈉能夠緩解酸雨脅迫降低龍眼幼苗的膜脂過(guò)氧化作用，從而保持膜的完整和流動(dòng)性，增加龍眼種子抗酸雨的能力。

圖3 模擬酸雨對(duì)龍眼幼苗葉片丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of simulated acid rain stress on MDA contents in the leaves of longan seedlings

圖4 硝普鈉對(duì)酸雨脅迫下龍眼幼苗葉片丙二醛含量的影響Fig.4 Effects of sodiumn nitroprusside on MDA contents in the leaves of longan seedlings under acid rain stress

3 討論

3.1 模擬酸雨對(duì)龍眼種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響

種子作為植物繁殖體，其萌發(fā)率高低、萌發(fā)速度快慢、出苗整齊與否及幼苗強(qiáng)弱與產(chǎn)量有密切關(guān)系。同時(shí)種子的萌發(fā)是植物整個(gè)生命史的關(guān)鍵，而生活在酸雨環(huán)境中的植物在萌發(fā)過(guò)程中的耐酸能力又是其幼苗建立的關(guān)鍵。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同pH值模擬酸雨對(duì)龍眼種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有不同程度的影響:pH 2.0～3.0時(shí)龍眼種子不發(fā)芽，pH 3.5～5.0時(shí)龍眼種子都能正常發(fā)芽，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)與pH呈正相關(guān);酸性較弱時(shí)(pH 5.0)，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、株高、生根數(shù)、根長(zhǎng)和根系活力較對(duì)照高，說(shuō)明一定的弱酸環(huán)境對(duì)龍眼種子的前期萌發(fā)有一定促進(jìn)作用。隨著酸性增強(qiáng)(pH≤4.5)，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、株高、生根數(shù)、根長(zhǎng)和根系活力均明顯降低;pH 4.0時(shí)對(duì)龍眼種子萌發(fā)產(chǎn)生明顯抑制作用。pH≤3.0時(shí)，龍眼種子已不能正常萌發(fā)，這可能是由于酸雨酸度過(guò)高，超過(guò)龍眼種子萌發(fā)的耐受極限，以及長(zhǎng)時(shí)間酸雨脅迫所致。這也與國(guó)內(nèi)外在小麥［14］、黃瓜［15］和紫花苜宿［16］上的報(bào)道結(jié)果一致。模擬酸雨對(duì)幼苗的生長(zhǎng)量影響明顯，酸雨顯著降低龍眼根系活力，影響龍眼幼苗根的生長(zhǎng)，及其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因而抑制幼苗植株的生長(zhǎng)，使幼苗株高和鮮質(zhì)量隨酸雨脅迫程度的增大而下降。

3.2 NO緩解模擬酸雨對(duì)龍眼種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響

硝普鈉是一種常用的外源NO供體。NO作為一種信號(hào)調(diào)節(jié)分子和活性氧清除劑能調(diào)節(jié)植物對(duì)生物與非生物脅迫的適應(yīng)反應(yīng)，但外源NO濃度過(guò)高時(shí)對(duì)生物體有毒害作用［1-4］。本研究結(jié)果表明，低濃度硝普鈉(0.05 mmol/L和0.25 mmol/L)能夠緩解較高濃度酸雨(pH 3.5)對(duì)龍眼種子萌發(fā)的抑制作用，提高酸雨脅迫下龍眼種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，促進(jìn)下胚軸伸長(zhǎng)和胚根的生長(zhǎng)，增加干物質(zhì)的積累。這是由于低濃度硝普鈉能提高酸雨脅迫下龍眼種子中過(guò)氧化酶的活性，降低丙二醛的積累。上述過(guò)程與硝普鈉緩解水分脅迫(滲透脅迫)的作用機(jī)制相似［8-11］。高濃度硝普鈉(1.00 mmol/L)處理的龍眼種子在酸雨脅迫下萌發(fā)能力下降，這可能是高濃度NO與O2·-相互作用生成大量的過(guò)氧亞硝酸根陰離子，后者經(jīng)質(zhì)子化后形成具有強(qiáng)氧化性的過(guò)氧亞硝酸，破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，具有生物毒性。因此，NO對(duì)酸雨脅迫下龍眼種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的雙重性。

龍眼種子對(duì)酸雨脅迫的響應(yīng)過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中涉及了許多的信號(hào)通路。而NO供體硝普鈉對(duì)酸雨脅迫下龍眼種子萌發(fā)及生理特性的影響也不僅僅影響著根系的活力和丙二醛含量的累積，其中涉及了很多種的酶類物質(zhì)。因此這些問(wèn)題有待于進(jìn)一步的解決。

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