孟 馨 呂景武 劉婷婷 王滌非 張 錦

(中國醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)院內分泌科，遼寧 沈陽 110001)

慢性炎癥反應在動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)屬于CC型趨化因子，可促進單核細胞黏附于血管內皮。糖尿病患者血漿葡萄糖水平持續(xù)增高產生蛋白和脂質非酶糖基化所形成的晚期糖基化終末產物(AGEs)是糖尿病病人主要特點之一〔1〕，本研究擬建立人臍靜脈內皮細胞體外培養(yǎng)模型，制備AGEs，觀察球形脂聯素(gAdAPN)對AGEs誘導血管內皮細胞表達MIP-1α的干預作用，明確脂聯素是否具有抗糖尿病As的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 gAdAPN、人血清白蛋白HSA、D-葡萄糖(美國Sigma公司);MIP-1α檢測試劑盒 (Santa Cruz公司);RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)。

1.1.2 人臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng)及鑒定 PBS沖洗新生兒臍帶靜脈腔，0.25%的胰蛋白酶后收集內皮細胞懸液，離心后用150 mg/L內皮細胞生長添加物，75μmol/L肝素、20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液吹打接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱內培養(yǎng)，融合后予0.125%的胰蛋白酶、0.02%EDTA消化傳代，第2～3代用于實驗。細胞經Ⅷ因子相關抗原免疫熒光染色鑒定。

1.2 方法

1.2.1 體外晚期糖基化終產物的制備 0.5 g HSA，3.0 g D-葡萄糖，1 000μg青霉素，500μg慶大霉素溶于0.5 mol/L PBS(pH7.4)10 ml中，0.22μm微孔膜濾過除菌，恒溫37℃避光孵育90 d，孵育結束以無菌的pH7.4的PBS透析，除去未結合的葡萄糖。以同樣條件，不含D-葡萄糖孵育液培養(yǎng)的HSA作為對照。制備的AGEs修飾的人血清白蛋白(AGE-HSA)經熒光分光光度計鑒定。

1.2.2 實驗分組 先介紹如何分組每組實驗重復3次。待細胞生長至亞融合狀態(tài)時，改用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，PBS洗滌細胞3次，進行下列分組處理:①用含不同濃度梯度(100、200、400 mg/L)AGE-HSA的培養(yǎng)液對內皮細胞體外培養(yǎng)60 min及gAdAPN 100 nmol/L作用30 min后再加入400 mg/L糖基化終產物作用內皮細胞60 min;②以相同濃度及作用時間的未修飾HSA作為對照組。

1.2.3 內皮細胞MIP-1α蛋白的檢測 內皮細胞接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，于不同時間點收集細胞，提取蛋白。每個樣品用15% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至硝酸纖維素膜上，洗膜、封閉、雜交后加入ECL化學發(fā)光系統顯影，感光后洗片。用美國Chemin Imager 5500型自動電泳凝膠成像分析儀進行MIP1-α蛋白相對定量分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS11.0進行統計學分析，數據以x±s表示，組間比較應用方差分析或檢驗。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下血管內皮細胞的形態(tài) 人臍靜脈內皮細胞在倒置顯微鏡下呈鋪路石狀排列(圖1)。

2.2 內皮細胞內MIP-1α蛋白的表達 Western印跡結果顯示，AGEs組內皮細胞MIP-1α蛋白的表達明顯高于對照組(P＜0.05)，且呈劑量依賴方式;經灰度值分析，各組內皮細胞內MIP-1α蛋白的表達量分別為對照組的1.12倍、1.47倍及1.98倍(P＜0.05)。gAdAPN干預組內皮細胞MIP-1α蛋白的表達降低至對照組的1.64倍(P＜0.05)。gAdAPN能降低AGEs誘導的內皮細胞MIP-1α蛋白的表達。見圖2。

圖1 血管內皮細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)(×400)

圖2 各組內皮細胞MIP-1α蛋白的表達

3 討論

趨化因子在白細胞遷移和浸潤到血管壁這一動脈粥樣硬化斑塊形成的關鍵早期步驟中起著重要作用〔2〕。MIP-1α，一種屬于趨化因子CC亞家族的單核細胞/巨噬細胞趨化因子，被證明有助于慢性炎癥的形成。糖尿病患者包括冠狀動脈、腦動脈和外周血管疾病等大血管并發(fā)癥發(fā)生率明顯增加，研究表明，AGEs通過多種途徑參與其中〔3～5〕。本課題組前期研究結果顯示，AGEs以時間及劑量依賴方式促進血管內皮細胞表達MIP-1α〔6〕，從而參與糖尿病動脈粥樣硬化的形成。

脂聯素是一種由脂肪組織分泌的具有抗炎和抗動脈粥樣硬化作用的蛋白質。研究表明脂聯素包含四個結構域:氨基末端的信號肽區(qū)、一小段非螺旋區(qū)、膠原結構域和羧基端的球形結構域，其中球形結構域(gAd)比全長脂聯素具有更強的生物學作用，是脂聯素主要的功能結構域。國內外研究表明，低脂聯素水平預示著冠心病的發(fā)生，提示脂聯素與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關〔7～9〕。脂聯素能夠特異性的與血小板源性生長因子結合，從而顯著抑制平滑肌細胞的增殖與遷移。脂聯素能抑制內皮細胞中血管細胞黏附因子、細胞間黏附因子及E-選擇素的表達，從而減少由腫瘤壞死因子-α誘導的單核細胞對人主動脈內皮細胞的黏附。gAd通過激活AMPK抑制血管內皮細胞凋亡。糖尿病人大血管并發(fā)癥的病理改變?yōu)閯用}粥樣硬化，但與非糖尿病病人相比發(fā)生早、進展快、預后差。本研究表明，gAdAPN能抑制糖基化終產物誘導人臍靜脈內皮細胞表達MIP-1α，可能延緩糖尿病AS的發(fā)生和發(fā)展，為糖尿病大血管并發(fā)癥的防治提供新的理論依據。

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