姚海濤 馬金麗 張曉波 王 濤 王淑秋

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的一種神經(jīng)退行性病變，其標(biāo)志性病理改變是細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積導(dǎo)致老年斑形成和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)。神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的tau蛋白異常磷酸化是這兩種病理改變的主要原因，在AD的發(fā)病機(jī)制中占有重要的地位。本實(shí)驗(yàn)觀察山茱萸多糖對(duì)AD大鼠海馬神經(jīng)元tau蛋白在Ser422位點(diǎn)、Ser396位點(diǎn)磷酸化水平的影響，探討其對(duì)AD大鼠神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康Wistar大鼠63只，購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其中青年組12只，體重(179±20)g;51只大鼠體重(225±25)g，隨機(jī)分為假手術(shù)組10只、AD模型組14只、多奈哌齊組14只、山茱萸多糖組13只。飼養(yǎng)室溫為20℃，自由進(jìn)食飲水，自然晝夜節(jié)律光照。

1.2 藥物和試劑 山茱萸多糖購(gòu)自寧波德康生物制品有限公司(批號(hào)20120110);Aβ1～40購(gòu)自上海瑞奇生物科技有限公司(批號(hào)RS130310);鹽酸多奈哌齊購(gòu)自濟(jì)南德信佳生物科技有限公司(批號(hào)12072701);兔抗鼠p-tau(Ser422)和兔抗鼠p-tau(Ser396)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;tau抗體和其他試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 動(dòng)物處理及給藥 按照60 mg/kg給大鼠連續(xù)腹腔注射D-半乳糖6 w，之后將AD模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于腦立體定位儀上，依《大鼠腦立體定位圖譜》〔1〕向海馬注入凝聚態(tài) Aβ1～401 μl，5 min內(nèi)注完，留針10 min后縫合皮膚待蘇醒;假手術(shù)組注入等量無菌生理鹽水;7 d后，多奈哌齊組每日以0.5 mg/kg灌胃，山茱萸多糖組每日以0.175 g/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組以等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)30 d。

1.4 指標(biāo)的檢測(cè)方法 采用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力;大鼠海馬p-tau(Ser422)、tau的表達(dá)采用免疫組化法，胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，圖像采集后使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算出圖像中陽(yáng)性染色的平均光密度值。大鼠海馬p-tau(Ser422)和p-tau(Ser396)表達(dá)采用Western印跡法檢測(cè)，使用Tanon GIS4.0凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，其結(jié)果以相對(duì)光密度值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，如數(shù)據(jù)資料符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用q檢驗(yàn)，采用單因素方差分析、F檢驗(yàn);如數(shù)據(jù)資料不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 山茱萸多糖對(duì)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與青年組比較，手術(shù)前和手術(shù)后大鼠逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，手術(shù)造模后大鼠的潛伏期也明顯長(zhǎng)于手術(shù)前(P＜0.01)，且進(jìn)行Aβ注射前各組大鼠逃避潛伏期與假手術(shù)組之間無明顯差異(P＞0.05)。AD模型組、多奈哌齊組和多糖組在造模后潛伏期無明顯差異(P＞0.05);與AD模型組比較，多奈哌齊組和多糖組在給藥30 d后逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.01)。假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、多糖組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)較青年組明顯減少(P＜0.05);AD模型組、多奈哌齊組和多糖組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)和游程比組間無顯著差別(P＞0.05)，且均顯著少于手術(shù)前(P＜0.01)，而且較假手術(shù)組均有顯著差異(P＜0.01)，組間比較結(jié)果顯示在手術(shù)前各組間無顯著差別;多奈哌齊和多糖均能顯著提高跨越平臺(tái)次數(shù)和游程比(P＜0.01)，但兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1～表3。

2.2 山茱萸多糖對(duì)各組大鼠海馬p-tau(Ser422)，tau表達(dá)的影響 與青年組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)tau蛋白陽(yáng)性染色減弱(P＜0.05)，而 p-tau(Ser422)蛋白陽(yáng)性染色明顯增強(qiáng)(P＜0.01);與模型組比較，多奈哌齊和山茱萸多糖ptau(Ser422)蛋白陽(yáng)性染色均明顯減弱(P＜0.05)，而tau蛋白陽(yáng)性染色均顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)，多奈哌齊組和山茱萸多糖組之間無明顯差別(P＞0.05)。見表4，圖1，圖2。

2.3 山茱萸多糖對(duì)各組大鼠p-tau(Ser396)和p-tau(Ser422)表達(dá)的影響 模型組大鼠海馬CA3區(qū)p-tau(Ser396)和p-tau(Ser422)蛋白陽(yáng)性染色較青年組和假手術(shù)組明顯增強(qiáng)(P＜0.01，P＜0.05);與模型組比較，多奈哌齊和山茱萸多糖可明顯降低 p-tau(Ser396)蛋白陽(yáng)性染色(均 P＜0.05)和 p-tau(Ser422)蛋白陽(yáng)性染色(P＜0.05)，而多奈哌齊組與山茱萸多糖組比較無明顯差別(P＞0.05)。見表5，圖3。

表1 山茱萸多糖對(duì)各組大鼠游程比的影響(x±s)

圖1 tau蛋白在大鼠海馬CA3區(qū)免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

圖2 大鼠海馬CA3區(qū)p-tau(Ser422)蛋白免疫組化結(jié)果(×400)

表2 山茱萸多糖對(duì)各組大鼠逃避潛伏期的影響(x ± s，s)

表3 山茱萸多糖對(duì)各組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)的影響(x±s)

表4 tau-2與p-tau(Ser422)蛋白在大鼠海馬CA3區(qū)的表達(dá)(x ± s，AOD)

表5 p-tau(Ser396)與p-tau(Ser422)在各組大鼠海馬的表達(dá)(x ± s，OD)

圖3 各組大鼠p-tau(Ser396)與p-tau(Ser422)在大鼠海馬區(qū)的免疫印跡表達(dá)

3 討論

Tau是一種分布于神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突內(nèi)的微管相關(guān)蛋白，具有促進(jìn)微管蛋白聚集和維持微管結(jié)構(gòu)的功能。在AD的起病與發(fā)展過程中，tau蛋白過度磷酸化可能是十分關(guān)鍵的核心環(huán)節(jié)，由于tau蛋白的過度磷酸化使其具有了神經(jīng)毒性〔2，3〕。研究已證明，過度磷酸化的tau是NFTs神經(jīng)纖維纏結(jié)形成的主要成分〔4〕，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖和多奈哌齊可明顯改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。AD模型組大鼠海馬非磷酸化tau蛋白明顯少于對(duì)照組，而磷酸化的tau蛋白水平增加。在山茱萸多糖治療后的AD模型大鼠海馬內(nèi)的tau蛋白有所提高，同時(shí)磷酸化水平明顯下降。tau蛋白的磷酸化位點(diǎn)共有45個(gè)，其中超過30個(gè)磷酸化位點(diǎn)位于Thr或Ser殘基〔5〕。一些研究發(fā)現(xiàn)在成年人腦中除Ser404位點(diǎn)外，Ser202、Ser396兩位點(diǎn)不發(fā)生磷酸化;但在 AD 患者 Ser202、Ser396、Ser404 以及 Ser235、Ser262、Ser422、Thr181、Thr231等很多位點(diǎn)均可發(fā)生磷酸化〔6〕。目前，很多學(xué)者認(rèn)為 Ser396、Ser422、Thr181、Thr231、Ser404 等磷酸化位點(diǎn)是輕度認(rèn)知功能障礙向AD過渡的可靠預(yù)報(bào)器〔7〕。本研究觀察到正常大鼠海馬中Ser396和Ser422位點(diǎn)有輕度磷酸化表達(dá)，而模型組表達(dá)量明顯增高，經(jīng)過山茱萸多糖和多奈哌齊干預(yù)后，其表達(dá)量下降，說明山茱萸多糖和多奈哌齊均能調(diào)解這兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)影響AD模型大鼠海馬中tau的磷酸化水平，但兩用藥組比較未見明顯差別。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)山茱萸及其多糖具有多種藥理作用〔8，9〕。本研究發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖參與調(diào)節(jié)AD大鼠海馬tau蛋白磷酸化過程，改善AD大鼠的病理發(fā)展程度。但由于AD發(fā)生和進(jìn)程的多環(huán)節(jié)、多層系性，以及對(duì)tau蛋白磷酸化調(diào)解的復(fù)雜性，山茱萸多糖調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化機(jī)制尚未十分明確，仍需更廣泛和深入的研究。

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