劉 暢 巴曉紅 閔連秋 劉學(xué)文 姜興千 程 雪

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

近年來免疫炎癥反應(yīng)在缺血性腦損傷中的作用已得到肯定。炎性細(xì)胞在腦缺血時激活，并產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)導(dǎo)致缺血部位的免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重神經(jīng)系統(tǒng)的損害。Toll樣受體(TLR)的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了人們對炎性機(jī)制的理解。TLR4是小膠質(zhì)細(xì)胞行使免疫功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體之一，TLR4信號成為一個激活小膠質(zhì)細(xì)胞和調(diào)節(jié)其功能的重要控制開關(guān)〔1〕。頭孢曲松能夠顯著改善缺血半暗帶內(nèi)神經(jīng)元的存活率〔2〕，但具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究頭孢曲松對局灶性腦缺血大鼠腦組織TLR4及TNF-α的作用，探討其神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 24只健康成年SD大鼠，雌雄各半，體重280～320 g〔由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號:SCXK(遼)2003-1007〕。隨機(jī)分為缺血組、頭孢曲松鈉預(yù)處理組及假手術(shù)組，每組8只。

1.2 給藥方法 頭孢曲松鈉:由上海新先鋒藥業(yè)有限公司提供(規(guī)格1.0 g，批號080560);TLR4和TNF-α試劑盒均購自武漢博士德生物試劑公司。預(yù)處理組每日腹腔注射(ip)頭孢曲松鈉，200 mg/kg，共5 d，假手術(shù)組和缺血組給予等量的生理鹽水腹腔注射，給藥方法及療程相同。

1.3 大鼠局灶性腦缺血模型的建立 參照文獻(xiàn)〔3〕，大鼠中動脈阻塞模型(MCAO)術(shù)前12 h禁食，以防手術(shù)時誤吸，不禁水。以10%水合氯醛麻醉，沿頸部正中行2～3 cm切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈及翼腭動脈。結(jié)扎頸總動脈近心端及翼腭動脈，在頸總動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端。于頸內(nèi)動脈近心端置動脈夾夾閉，距頸總動脈分叉處近心端0.5 cm處將頸總動脈剪一小口，插入備好的尼龍線栓，去除動脈夾，沿頸內(nèi)動脈輕輕向前推進(jìn)至大腦前動脈(深約18 mm)，結(jié)扎頸內(nèi)動脈并固定線栓。假手術(shù)組不插入線栓，其余過程相同。模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠即刻出現(xiàn)同側(cè)Horner征。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評分 參考Zea Longa法〔4〕5分制評分標(biāo)準(zhǔn):①0分:無神經(jīng)缺損癥狀。②1分:輕微神經(jīng)缺損癥狀，不能完全伸展對側(cè)前爪。③2分:中度局灶性神經(jīng)缺損癥狀，爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。④3分:重度局灶性神經(jīng)缺損癥狀，行走時向?qū)?cè)傾斜。⑤4分:不能自發(fā)行走，意識改變。于大鼠MCAO術(shù)后約2 h清醒至24 h內(nèi)進(jìn)行3次評分，取平均值。

1.5 缺血腦組織TLR4和TNF-α免疫組化法檢測 術(shù)后24 h取材。水合氯醛腹腔注射麻醉后，于頸正中偏右切開，以4%多聚甲醛約50 ml局部灌流內(nèi)固定后，斷頭取腦。依次酒精脫水，石蠟包埋，行5μm厚的連續(xù)切片。①常規(guī)脫蠟、水化;②高壓熱修復(fù)抗原;③滴加正常山羊血清封閉液;④滴加1∶100稀釋的TLR4及TNF-α一抗，4℃下過夜;⑤添加生物素化二抗;⑥滴加試劑SABC;⑦DAB顯色;⑧蘇木素復(fù)染;⑨脫水、透明、封片。于每片右側(cè)頂葉皮層和海馬CA1區(qū)各取10個高倍鏡視野(10×40)，胞質(zhì)有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞(TLR4及TNF-α蛋白陽性細(xì)胞均為胞質(zhì)染色)，取每個視野陽性細(xì)胞數(shù)平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，用x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的變化 缺血組神經(jīng)功能評分(2.48±0.93)較假手術(shù)組(0)顯著升高(P＜0.01)，頭孢曲松預(yù)處理組(1.52±0.80)則低于缺血組(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)TLR4表達(dá)的比較 假手術(shù)組可見存在少量TLR4陽性細(xì)胞;缺血組大鼠腦組織中TLR4陽性細(xì)胞率高于假手術(shù)組(P＜0.01);與缺血組比較，預(yù)處理組TLR4陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.01)。見圖1和表1。

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)TNF-α蛋白表達(dá)的影響 假手術(shù)組TNF-α少量表達(dá)，腦缺血組TNF-α表達(dá)迅速上升，部位主要分布于海馬組織和缺血半暗帶，與假手術(shù)組比較，有明顯差異(P＜0.01);與缺血組比較，預(yù)處理組TNF-α的表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)。見圖2和表1。

圖1 3組大鼠腦組織TLR4蛋白的表達(dá)(SP，×400)

圖2 3組大鼠腦組織TNF-α蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表1 各組TLR4和TNF-α陽性表達(dá)率的比較(x ± s，n=8)

3 討論

腦梗死后，壞死及缺血區(qū)域因急性缺血而觸發(fā)炎性瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致過度的炎性損傷，成為神經(jīng)元死亡的重要機(jī)制之一〔5〕。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加與缺血再灌注后腦損傷的程度呈正相關(guān)，即小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化加重了缺血后腦損傷的發(fā)生〔6〕。

TLRs是一個介導(dǎo)天然免疫的古老家族，迄今為止至少有10種TLRs類型，其中對TLR4的研究最廣泛。TLR4在人和鼠腦中均有大量的表達(dá)，主要分布在小膠質(zhì)細(xì)胞。研究表明，在炎癥損傷的過程中小膠質(zhì)細(xì)胞是損傷遞質(zhì)的主要來源，TLR4在誘導(dǎo)中樞神經(jīng)損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用〔7〕。TLR-4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括髓樣分化蛋白88(Myd88)依賴性和非依賴性，激活后將信號傳遞至NF-κB，引起TNF-α、白介素、干擾素-β等炎性因子的瀑鏈?zhǔn)郊せ疃a(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)〔8，9〕。Cao 等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后TLR4缺陷的大鼠通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，下調(diào)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生來減少炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)顯示頭孢曲松鈉可以顯著降低大鼠缺血腦組織中TLR4的表達(dá)水平，推測頭孢曲松鈉可能通過TLR4及其信號傳導(dǎo)通路抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

TNF-α是重要的促炎反應(yīng)介質(zhì)，主要來源于活化的膠質(zhì)細(xì)胞，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞，具有復(fù)雜的生物學(xué)活性〔11〕。目前認(rèn)為，TNF-α介導(dǎo)了腦梗死后引起的炎性損傷〔12〕。目前認(rèn)為，腦內(nèi)TNF-α主要通過3條途徑加劇炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞的損傷:①激活NF-κB途徑，導(dǎo)致炎性因子的大量表達(dá)，從而啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重神經(jīng)損傷;②促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，引起血管炎癥反應(yīng)，增加了血管對外周炎癥細(xì)胞的通透性，從而加重腦缺血及腦水腫;③細(xì)胞內(nèi)NO合酶的表達(dá)增加。

本實(shí)驗(yàn)表明TNF-α參與了腦缺血炎性損傷過程。CTX通過抑制缺血后TNF-α的表達(dá)，減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，對照組及頭孢曲松預(yù)處理組的對側(cè)皮質(zhì)中均有TNF-α蛋白的表達(dá)，但表達(dá)量均小于缺血側(cè)。但在缺血對側(cè)的皮層中，TLR4的表達(dá)無明顯增加，但不能完全說明缺血對側(cè)的TNF-α可能與TLR4的激活無關(guān)，也可能與樣本量小有關(guān)，需進(jìn)一步探討。

本文提示TLR4和TNF-α參與了缺血性腦損傷的炎性反應(yīng)過程，頭孢曲松預(yù)處理具有抑制缺血后腦組織TLR4和TNF-α表達(dá)的作用，通過抑制損傷后炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但TLR4如何被激活，以及信號傳導(dǎo)過程有待于進(jìn)一步研究。

1 Yang J，Ding JW，Chen LH，et al.Sequential expression of TLR4 and its effects on the myocardium of rats with myocardial ischemia-reperfusion in-jury〔J〕.Inflammation，2008;31:304-12.

2 Th?ne-Reineke C，Neumann C，Namsolleck P，et al.The beta-lactam antibiotic，ceftriaxone，dramatically improves survival，increases glutamate uptake and induces neurotrophins in stroke〔J〕.Hypertension，2008;26(12):2426-35.

3 陳佳俊，石巖殊，韓雪梅，等.線拴法大鼠局灶性腦缺血模型(PMCAO)的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.吉林醫(yī)學(xué)，2004;25(10):16-7.

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20:84-91.

5 Denes A，Thornton P，Rothwell NJ，et al.Inflammation and brain injury:acute cerebral ischaemia，peripheral and central inflammation〔J〕.Brain Behav Immun，2010;24(5):708-23.

6 韓書珍，王 果，李澤宜，等.CLSM觀察大鼠局灶性腦缺血半暗區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的變化及意義〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2010;5(27):399-403.

7 Laflamme N，Echchannaoui H，Landmann R，et al.Cooperation between Toll-like receptor 2 and 4 in the brain ofmice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria〔J〕.Eur J Immunol，2003;33(8):1127-38.

8 Wang H，Li ZY，Wu HS，et al.Endogenous danger signals trigger hepatic ischemia/reperfusion injury throngh toll-like recepter4/nuclear factorkappa β pathway〔J〕.Chin Med JEngl，2007;120(6):509-14.

9 Rowe DC，McGettrick AF，Latz E，et al.The myristoylation of TRIF-related adaptor molecule is essential for Toll-like receptor 4 signal transduction〔J〕.Proc Natl ACAD Sci USA，2006;103(16):6299-304.

10 Cao CX，Yang QW，Lv FL，et al.Reduced cerebral ischemia-reperfusion injury in Toll like receptor 4 deficient mice〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007;353(2):509-14.

11 Sergeeva SP，Erofeeva LM，Gultiaev MM.IL-1beta，IL-10，INF-gamma，TNF-alpha，S100beta，AMA-M2 and cell immune response in stroke〔J〕.Patol Fiziol Eksp Ter，2011;3(1):41-5.

12 Munshi A，Rajeshwar K，Kaul S，et al.Association of tumor necrosis factor-α and matrix metalloproteinase-3 gene variants with stroke〔J〕.Eur J Neurol，2011;18(8):1053-9.