姜紅霞，楊成德，薛莉，蒲崇建，陳秀蓉＊，尚勛武，李昌盛

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省植保植檢站，甘肅 蘭州730020；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室 中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是世界第四大糧食作物，僅次于小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）。世界上栽培馬鈴薯的國家共有148個(gè)，主要分布在亞洲和歐洲等地。目前，我國是世界上最大的馬鈴薯種植國［1］，糧飼兼用，且馬鈴薯塊莖含有一些次生代謝物具有廣泛的生態(tài)學(xué)效應(yīng)，如抵御病原微生物侵襲和拒避食草昆蟲采食，在醫(yī)療上還具有廣泛的藥理學(xué)活性，如抗菌、抗病毒、抗原蟲、抗炎、抗腫瘤、強(qiáng)心、抗膽堿酯酶等［2］；馬鈴薯可以單種，也可以套種，不同栽培方式影響馬鈴薯產(chǎn)量［3］。甘肅省栽培歷史悠久，目前種植面積約6.7萬hm2，87個(gè)縣（市、區(qū)）中有60個(gè)縣種植馬鈴薯，甘肅定西有著“馬鈴薯之鄉(xiāng)”之稱，馬鈴薯是甘肅省各市縣農(nóng)民解決溫飽和脫貧致富的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。然而隨著種植面積的擴(kuò)大，重茬嚴(yán)重，病蟲害發(fā)生日益嚴(yán)重，已成為限制甘肅省馬鈴薯穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的主要因素之一，特別是馬鈴薯貯藏期病害對(duì)馬鈴薯種薯危害嚴(yán)重，造成良種損失嚴(yán)重，給生產(chǎn)上優(yōu)良種薯的貯存及供應(yīng)帶來了顯著影響，如2004年定西市馬鈴薯貯藏期平均病薯率達(dá)29.4%。近年來，馬鈴薯貯藏期病害逐年加重，2008和2009年調(diào)查，定西市安定區(qū)馬鈴薯主裁品種新大坪的脫毒一級(jí)種薯爛薯率高達(dá)50%以上，新大坪原種平均爛薯率為25.4%，隴薯3號(hào)一級(jí)種爛薯率10%～15%，嚴(yán)重的高達(dá)30%左右。經(jīng)調(diào)查，2009年甘肅省部分縣（區(qū)）薯塊腐爛的主要癥狀表現(xiàn)明顯不同于晚疫病等以往發(fā)生的病害，查閱相關(guān)資料，為疑似馬鈴薯壞疽病。馬鈴薯壞疽病主要危害馬鈴薯，是馬鈴薯貯藏期重要病害之一［4］，也可以侵染藜屬（Chenopodium）的一些植物［5］；此病被我國列為對(duì)外檢疫對(duì)象，目前主要在歐洲、北非、新西蘭、南美和澳大利亞等地［6－9］發(fā)生。因此，為了有效地控制該病害，2009和2010年對(duì)該病害的病原進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性及有效化學(xué)農(nóng)藥等進(jìn)行了室內(nèi)篩選，以期為甘肅省該病害的綜合防治及馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試標(biāo)本：2009年3月采集于定西市安定區(qū)等地馬鈴薯貯藏庫。

供試儀器：水平凝膠電泳裝置（Bioneer公司）；MyGenie32Thermal Block PCR熱循環(huán)儀（Bioneer公司）；凝膠成像系統(tǒng)Uvitec A－6030（Bioneer公司）；高速冷凍離心機(jī)（Biometra公司）等。

供試生化試劑：蛋白酶K、DNATaq聚合酶和LD2000Marker購置于上海生工生物技術(shù)公司；其他試劑均采用國產(chǎn)分析純。選用通用引物ITS1和ITS4（上海生物工程有限公司合成）為擴(kuò)增引物，引物序列分別如下：ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G；ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC。

供試化學(xué)農(nóng)藥：70%丙森鋅可濕性粉劑（天津市阿格羅帕克農(nóng)藥有限公司）；70%代森錳鋅可濕性粉劑（天津施普樂農(nóng)藥技術(shù)有限公司）；68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑（先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）；32.5%苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯懸浮液（先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）；30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑乳油（先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）；5%菌毒清（山東勝邦綠野化學(xué)有限公司）；35%多菌靈磺酸鹽（新沂中凱農(nóng)化有限公司）。

1.2 標(biāo)本采集和分離

2009年3月在甘肅省馬鈴薯主要種植區(qū)的貯藏庫采集發(fā)病塊莖，進(jìn)行常規(guī)組織分離培養(yǎng)，將分離獲得的真菌鏡檢，莖點(diǎn)霉屬（Phomaspp.）真菌進(jìn)行致病性測定。

1.3 致病性測定

將分離得到的莖點(diǎn)霉屬分離物配制成106個(gè)孢子（菌絲片段）／mL溶液噴霧到帶傷口的馬鈴薯塊莖（品種為新大坪）表面，保濕72h，之后置于15℃培養(yǎng)箱中，定期觀察接菌馬鈴薯塊莖，形成典型癥狀后進(jìn)行再分離和鑒定，以接種無菌水為對(duì)照，經(jīng)致病性測定具有致病能力的分離物進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.4 病原菌的鑒定

形態(tài)學(xué)及生化鑒定：將病原菌分別接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、燕麥培養(yǎng)基（OA）和麥芽培養(yǎng)基（MA）上20℃恒溫培養(yǎng)，測量菌落生長速度；光學(xué)顯微鏡（10×40倍）下觀察病原菌分生孢子器形態(tài)、分生孢子形態(tài)和厚垣孢子有無等并照相，測量其大小；根據(jù)病原形態(tài)特征，參考相關(guān)資料［5，7］，確定屬種。將病原菌接種于OA，置于20℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d后用氨氣熏蒸［10］和加酸加堿反應(yīng)［11］，觀察顏色變化情況；將病原菌多點(diǎn)接種于平板OA，觀察菌落間形成的黑線［12］。

ITS序列分析：將病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在25℃、150r／min條件下振蕩培養(yǎng)5～7d后收集菌絲體，采用UNIQ－10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生物工程有限公司）提取病原菌基因組DNA，取5.0μL電泳檢查提取結(jié)果。rDNA－ITS的擴(kuò)增利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增使用50μL擴(kuò)增體系，即為：10×PCR Buffer 5.0μL，Taq DNA聚合酶（2U／μL）1.2μL，ITS1（10mmol／L）2.0μL，ITS4（10mmol／L）2.0μL，dNTP（10mmol／L）3.0μL，DNA 模板（10ng／μL）2.0μL（以加2.0μL ddH2O為陰性對(duì)照），ddH2O 34.8μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min，30個(gè)循環(huán)中，94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃延伸8min。擴(kuò)增后取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，具特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序。所測序列進(jìn)入GenBank數(shù)據(jù)庫（www.Ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行相似性分析，并與GenBank中的相似序列在Claustal（1.81）程序包中進(jìn)行多重序列匹配排列（Multiple Alignmemts）分析，形成一個(gè)多序列匹配排列陣，其中形成的缺口用橫杠“－”填補(bǔ)，用 MEGA（4.0）程序包中的Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 病原菌的生物學(xué)特性研究

將純化保存的菌種，在適溫下置PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，參考有關(guān)文獻(xiàn)［13－15］進(jìn)行以下試驗(yàn)，所得結(jié)果采用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

溫度對(duì)菌絲生長的影響：將接菌培養(yǎng)皿置于2，5，10，15，20，25和30℃的溫箱中進(jìn)行觀察，3d后用十字交叉法每天測量菌落大小。

培養(yǎng)基種類對(duì)菌絲生長的影響：將病原菌接種于不同培養(yǎng)基平板中央，置于20℃、黑暗培養(yǎng)，3d后用十字交叉法測量菌落大小，并觀察不同培養(yǎng)基上菌落特征。

溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響：用無菌水配制孢子懸浮液，孢子濃度1.2×105個(gè)／mL，懸滴法培養(yǎng)，分別置于2，5，10，15，20，25和30℃7個(gè)處理下，每隔2h鏡檢各處理的孢子萌發(fā)率，每處理重復(fù)3次，鏡檢至少3個(gè)視野，100個(gè)孢子。

pH值對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響：用磷酸緩沖液將pH值分別調(diào)至3，4，5，6，7，8，9和10后配制孢子懸浮液，懸滴法制片，其他同上。

1.6 病原菌的室內(nèi)毒力測定

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，供試殺菌劑的試驗(yàn)濃度見表1。采用生長速率法測定不同藥劑對(duì)病原菌的抑制率和計(jì)算藥劑對(duì)病原菌的抑制率、毒力回歸方程和EC50值［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯壞疽病原的分離與致病性測定

從病薯上直接挑取小黑點(diǎn)進(jìn)行分離培養(yǎng)，在26份標(biāo)本中共分離得到8個(gè)真菌分離物，將該分離物接種于帶傷口的健康馬鈴薯塊莖，置于15℃下14d后出現(xiàn)了典型癥狀，4～6周在病斑上形成小黑點(diǎn)，經(jīng)鏡檢與原接種分生孢子器及分生孢子形態(tài)一致，而對(duì)照上沒有典型癥狀出現(xiàn)。因此，確認(rèn)所分離到的微生物為該病害的病原菌。而且，經(jīng)鏡檢，在樣品上所分離得到的8種真菌分離物的培養(yǎng)性狀、菌絲形態(tài)、分生孢子和分生孢子器大小及在馬鈴薯上引起的癥狀均一致，因此，認(rèn)為多份樣品上的分離物為同一種微生物，則將該分離物確定為病原物進(jìn)行以下試驗(yàn)。

2.2 馬鈴薯壞疽病原的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征及生化鑒定 對(duì)分離得到的病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～9d，后轉(zhuǎn)到5℃條件下培養(yǎng)大約30d后出現(xiàn)分生孢子器，鏡檢分生孢子器褐色，球形、扁圓形，散生或多個(gè)聚集，具孔口，內(nèi)生大量分生孢子（圖1－1），遇水或擠壓后分生孢子像擠牙膏式的從孔口涌出，分生孢子橢圓形或卵園形，單胞、無色，偶雙胞，有的兩端各具2個(gè)油球（圖1－2），在PDA培養(yǎng)基上分生孢子大小為2.5～4.4μm×4.7～9.2μm，分生孢子器大小為82～210μm×64～175μm，厚坦孢子球形或近球形，多串生（圖1－3），大小為27～81μm×18～63μm。此與文獻(xiàn)報(bào)道［5］的Phoma foveata 的特征一致。

該病原菌在麥芽培養(yǎng)基上培養(yǎng)后用氨氣熏蒸可變?yōu)榧t色，在麥芽培養(yǎng)基上培養(yǎng)后先加堿（氫氧化鈉），約10 min后培養(yǎng)基及堿液均變?yōu)榧t色，再加酸之后約30s培養(yǎng)基及酸液均變?yōu)辄S色，時(shí)間越長，黃色越明顯；在OA平板上不同菌落間可以形成黑線，且后期可以形成黃綠色針狀結(jié)晶體。

該病原菌在PDA和燕麥培養(yǎng)基上生長速率不一致，在PDA培養(yǎng)基上生長較快，7d后滿皿，在燕麥培養(yǎng)基和麥芽培養(yǎng)基上生長較慢，7d為7.1cm。

根據(jù)病原形態(tài)、病原生長速率、生化反應(yīng)和致病性測定結(jié)果，參考相關(guān)文獻(xiàn)［4－6，11］，鑒定此病原菌為Phoma foveata，該病害為馬鈴薯壞疽病。

圖1 病原形態(tài)Fig.1 Morphology of pathogens

2.2.2 ITS序列分析 采用UNIQ－10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取壞疽病菌基因組DNA，經(jīng)電泳檢測，其特異性和純度等能滿足PCR擴(kuò)增反應(yīng)的要求（圖2）。

在引物ITS1和ITS4的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker－DL2000為對(duì)照，在500bp處有1條明顯的特異性擴(kuò)增條帶，即為獲得的目的ITS rDNA片斷（圖3），將該擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測序。

圖2 壞疽病菌基因組DNA電泳Fig.2 Electrophoretic pattern of the total DNA of P.foveata

圖3 壞疽病菌ITS rDNA PCR電泳Fig.3 Electrophoretic pattern of ITS rDNA sequence of P.foveata

將所測定的壞疽病菌的ITS rDNA序列輸入GenBank中比對(duì)后，搜索下載同源性最高的序列，與GenBank中的菌株P(guān).foveataAJ301723、P.foveataGU237742等7個(gè)序列使用Claustle（1.8）進(jìn)行多重序列比較，再用 Mega 4.0軟件以最大簡約法（Neighbor－Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，壞疽病菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中與各菌株的同源性都在99%以上，其中與P.foveataGU237742同源性達(dá)100%，說明其親緣關(guān)系最近（圖4）。

圖4 馬鈴薯壞疽病菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of P.foveata

圖5 溫度對(duì)菌絲生長的影響Fig.5 Effect of temperature on colony growth

2.3 生物學(xué)特性研究

2.3.1 溫度對(duì)菌絲生長的影響 在2～30℃條件下，該菌菌絲均能生長，但除10℃至25℃之間外不同溫度間均差異顯著（P＜0.05）。在20℃時(shí)7d菌落直徑達(dá)80.1mm，顯著高于其他溫度處理（P＜0.05），說明20℃是該菌菌絲生長的最適宜溫度，但高溫明顯抑制菌絲的生長（圖5）。

2.3.2 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響 在PDA培養(yǎng)基上菌落直徑（75.9mm）顯著大于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），PSA培養(yǎng)基上其次，而在馬丁氏培養(yǎng)基上菌落直徑（33.6mm）顯著小于其他培養(yǎng)基（P＜0.05）。說明不同培養(yǎng)基對(duì)該菌菌絲的生長有影響，其中PDA培養(yǎng)基最適宜其生長，而馬丁氏培養(yǎng)基則不利于其生長（圖6）。

該菌在不同培養(yǎng)基上的菌落特征有差異，具體如下：

PDA：從菌落的背面觀察為黃色，正面為灰色，菌落邊緣整齊，較厚，表面有不明顯輪紋。

PSA：從菌落的背面觀察為黃色，正面為灰白色，表面有明顯的輪紋，邊緣整齊，較厚。

馬丁氏培養(yǎng)基：菌落正反面均為白色，氣生菌絲疏松，老菌絲顏色較深，為灰色，菌落邊緣整齊，質(zhì)地薄，菌餅上有氣生菌絲。

燕麥培養(yǎng)基：菌落正反面均為白色，氣生菌絲疏松，菌落較薄，邊緣整齊，菌餅上氣生菌絲較多。

麥芽糖培養(yǎng)基：菌落正反面均為灰色，氣生菌絲疏松，菌落較厚，邊緣呈放射狀，菌餅上氣生菌絲較多。

玉米粉培養(yǎng)基：從菌落反面觀察為黃色，正面為灰色，氣生菌絲少，菌落較薄，邊緣整齊，菌餅上有較多氣生菌絲。

查理固體培養(yǎng)基：從菌落反面觀察為黃色，正面為灰色，有紅色色素產(chǎn)生，菌落表面有不規(guī)則的輪紋，邊緣不規(guī)則，菌餅上有較多氣生菌絲。

查彼固體培養(yǎng)基：菌落正反面均為白色，較薄，邊緣不規(guī)則，老菌絲顏色深，菌餅上有氣生菌絲。

2.3.3 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響 馬鈴薯壞疽病菌分生孢子在2～30℃內(nèi)均可萌發(fā)，其中在2，5和30℃間差異不顯著（P＞0.05），且顯著低于其他溫度處理（P＜0.05），20℃下孢子萌發(fā)率顯著高于其他溫度條件（P＜0.05）。該結(jié)果說明馬鈴薯壞疽病菌分生孢子萌發(fā)溫度范圍較廣，但高溫明顯抑制孢子的萌發(fā)，且分生孢子萌發(fā)最適溫度與菌絲生長最適溫度一致，均為20℃（圖7）。

2.3.4 pH值對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響 馬鈴薯壞疽病菌分生孢子在pH值為3～10時(shí)均能萌發(fā)，在pH值為3，8，9和10時(shí)萌發(fā)率介于11%～13%，顯著低于其他溫度處理（P＜0.05），在pH值為6時(shí)，萌發(fā)率可達(dá)29%，顯著高于其他溫度處理（P＜0.05）。該結(jié)果說明，pH為6時(shí)，有利于分生孢子的萌發(fā)；總體上酸性有利于分生孢子的萌發(fā)，堿性時(shí)分生孢子也能萌發(fā)，但萌發(fā)率較低，即該分生孢子對(duì)酸堿度適應(yīng)性強(qiáng)，但更適宜偏酸性條件（圖8）。

圖6 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響Fig.6 Effect of meadia on colony growth

圖7 溫度對(duì)孢子萌發(fā)的影響Fig.7 Effect of temperature on germination ratio

圖8 pH對(duì)孢子萌發(fā)的影響Fig.8 Effect of pH value on germination ratio

2.4 病原菌的室內(nèi)毒力測定

2.4.1 化學(xué)藥劑對(duì)菌絲生長的影響 8種藥劑對(duì)馬鈴薯壞疽病菌均有抑制作用，其中10%苯醚甲環(huán)唑WG、5%菌毒清AS、32.5%苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯SE、70%代森錳鋅WP、30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑EC、35%多菌靈磺酸鹽 WP、68%精甲霜·錳鋅 WG和70%丙森鋅WP，在其濃度下對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的相對(duì)抑制率均較高，除68%精甲霜·錳鋅WG和70%丙森鋅WP外其抑菌率均在90%以上（表1）。

表1 8種殺菌劑對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的相對(duì)抑制率Table 1 The inhibition effect of different fungicides on hypha growth of P.foveata

2.4.2 8種殺菌劑的毒力比較 對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑EC、35%多菌靈磺酸鹽WP、5%菌毒清AS、10%苯醚甲環(huán)唑WG、32.5%苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯SE、70%丙森鋅 WP、70%代森錳鋅 WP和68%精甲霜·錳鋅 WG，8種藥劑的EC50值分別為2.43×10－5，1.77×10－2，7.40×10－2，1.31×10－1，2.31×10－1，1.10，2.90和2.46×102μg／mL。其中，供試馬鈴薯壞疽病原菌對(duì)30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑EC特別敏感，其EC50的值為2.43×10－5μg／mL，對(duì)68%精甲霜·錳鋅 WG最不敏感，EC50的值為2.46×102μg／mL（表2）。

表2 12種殺菌劑對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的毒力測定Table 2 The toxicity determination of different fungicides to potato gangrene caused by P.foveata

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯壞疽病為國外報(bào)道的馬鈴薯貯藏期重要病害之一［4］，其主要寄主為馬鈴薯，也可以侵染藜屬的一些植物［5］；其在歐洲、北非、新西蘭、南美和澳大利亞等多個(gè)國家［6－9］發(fā)生。近年來，在冷涼地區(qū)，馬鈴薯貯藏期干腐?。‵usariumspp.）逐漸下降，而壞疽病卻在上升，且由于種薯分級(jí)等造成大量傷口及長時(shí)間的貯存發(fā)生更嚴(yán)重，在田間一般發(fā)生較輕，但種植發(fā)病輕重的種薯也可以引起20%的產(chǎn)量損失及小薯增加［7］，現(xiàn)被我國列為進(jìn)境檢疫性有害生物，在我國系首次詳細(xì)報(bào)道。1967年Boerema［11］認(rèn)為馬鈴薯壞疽病菌P.foveata與馬鈴薯貯藏期的另一病原菌P.exigua在形態(tài)上一致，只是前者產(chǎn)生色素，而后者不產(chǎn)生色素，因此將其歸入P.exigua下的一個(gè)變種，即為P.exiguavar.foveata，但在1987年Boerema等［17］認(rèn)為P.exigua和P.exiguavar.foveata間形態(tài)及致病力等方面差異較大，建議恢復(fù)其P.foveata的名稱，即在1940年到1967年及1987年后病原拉丁學(xué)名為P.foveata，鑒定主要以形態(tài)特征為依據(jù)，在1967到1987年間病原拉丁學(xué)名為P.exiguavar.foveata，在形態(tài)特征鑒定的基礎(chǔ)上以生化特性及寄主范圍為依據(jù)進(jìn)行鑒定，在生化特性中主要特征是蒽醌色素的有無，如Boerema等［11］1967年報(bào)道了該病害病原菌所產(chǎn)生色素在酸性條件下變黃，在堿性條件下變紅；在半選擇培養(yǎng)基上菌株間可以形成黑線［12］；在1%麥芽培養(yǎng)基中加入25mg／kg的甲基托布津不僅可加速形成黃色晶體（色素），且增加了數(shù)量，同時(shí)兩變種在培養(yǎng)性狀上差異很大［18］；P.foveata在PDA培養(yǎng)基上可形成蒽醌色素，因此將病組織或純培養(yǎng)在溶漿機(jī)中搗碎，并用氯仿浸提，浸提液在55℃蒸發(fā)，后噴于硅膠板層析（層析液為甲苯∶丙酮＝95∶5，v／v），后在波長為366nm下觀察，可看到特異性條帶，且與商品大黃酸中的部分成分一致，將10%的KOH甲醇液噴于其上，條帶變紅［19］；培養(yǎng)的該菌經(jīng)氨氣熏蒸，可使蒽醌色素變紅［10］；Weijman等［20］報(bào)道了用氣相色譜法診斷該病害的方法，認(rèn)為比以前分離病原物鑒定或用硅膠板鑒定蒽醌色素要靈敏和具有特異性，但其本質(zhì)仍然是鑒定所產(chǎn)生的色素；只有Virgilio等［21］報(bào)道了用RAPD方法區(qū)分P.exigua和P.foveata，即從遺傳上區(qū)分這兩個(gè)種。本試驗(yàn)中，按參考文獻(xiàn)［5］，以形態(tài)學(xué)結(jié)合蒽醌色素特征為主要依據(jù)進(jìn)行了傳統(tǒng)鑒定，同時(shí)利用ITS序列進(jìn)行了同源性分析，壞疽病菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中各菌株的同源性都在99%以上，其中與P.foveataGU237742同源性達(dá)100%，說明其親緣關(guān)系最近。

該病原菌菌絲生長速率及分生孢子萌發(fā)率均在20℃時(shí)最高；在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及生長速率均有差異，其中在PDA培養(yǎng)基上生長最快；在pH值為6時(shí)分生孢子萌發(fā)率最高，且偏酸性有利于該病原菌分生孢子的萌發(fā)。目前，在防治馬鈴薯貯藏期病害上使用的高效藥劑并不多，本試驗(yàn)室內(nèi)毒力測定中30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑EC、35%多菌靈磺酸鹽、5%菌毒清、10%苯醚甲環(huán)唑 WG、32.5%苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯SE、70%丙森鋅WP、70%代森錳鋅的毒力系數(shù)均較小，理論上均為較好的防治藥劑，但室內(nèi)的毒力測定結(jié)果僅僅說明殺菌劑對(duì)在離體條件下對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的直接活性，不能顯示不同藥劑在田間應(yīng)用效果，所以這些藥劑還需在大田進(jìn)一步試驗(yàn)篩選。

［1］ 王典，李發(fā)弟，張養(yǎng)東，等.馬鈴薯淀粉渣－玉米秸稈混合青貯料對(duì)肉羊生產(chǎn)性能、瘤胃內(nèi)環(huán)境和血液生化指標(biāo)的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（5）：47－54.

［2］ 牛繼平，張金文，王旺田，等.馬鈴薯SGAs合成代謝途徑末端SGT酶基因克隆及序列分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（3）：106－116.

［3］ 范士杰，王蒂，張俊蓮，等.不同栽培方式對(duì)馬鈴薯土壤水分狀況和產(chǎn)量的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（2）：271－279.

［4］ Langerfeld E.Phoma exigua var.foveata，cause of a tuber rot of potatoes［J］.Gesunde Pflanzen，1980，32（4）：92－95.

［5］ Boerema G H，de Gruyter J，Noordeloos M E，et al.Phoma Identification Manual，Differentiation of Specific and Infra－specific Taxa in Culture［M］.Wallingford：CABI Publishing，2004：215－220.

［6］ Stevenson W R，Loria R，F(xiàn)ranc G D，et al.Compendium of Potato Diseases（2nd）［M］.Minnesota：APS Press，2004：25－26.

［7］ EPPO.Phoma exigua var.foveatadata sheets on quarantine pests［A］.Prepared by CABI and EPPO for the European Union［M］.Cambridge：Quarantine pests for Europe University Press，1997：865－871.

［8］ Otazu V，Boerema G H，Mooi J C，et al.Possible geographical origin of Phoma exigua var.foveata，the principal causal organism of potato gangrene［J］.Potato Research，1979，22：333－338.

［9］ 全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心.植物檢疫性有害生物圖鑒［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：396－397.

［10］ Domsch K H，Gams W.農(nóng)業(yè)土壤真菌［M］.韓紹英，譯.北京：科學(xué)出版社，1979：228－229.

［11］ Boerema G H.The phoma organisms causing gangrene of potatoes［J］.Netherlands Journal of Plant Pathology，1967，73：190－192.

［12］ Turkknsteen L J.Dark lines formed between colonies of isolates of Phoma exigua var.foveata on a semi－selective medium［J］.Netherlands Journal of Plant Pathology，1987，93：87－90.

［13］ 張益先，呂國忠，梁景頤，等.玉米灰斑病菌生物學(xué)特性研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2003，33：292－295.

［14］ 張君成，張炳欣，陳志誼，等.稻曲病菌分生孢子的生物學(xué)研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2003，33：44－47.

［15］ 方中達(dá).植病研究法（第三版）［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：122－154.

［16］ 齊永霞，陳方新，李欠欠.幾種殺菌劑對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力測定［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（1）：169－171.

［17］ Boerema G H，Loerakker W M，Hamers M E C.Check－list for scientific names of common parasitic fungi.Supplement Series 2a（additions and corrections）.Fungi on field crops：beet and potato；caraway，fiax and oil seed poppy［J］.Netherlands Journal of Plant Pathology，1987，93：1－20.

［18］ Tichelaar G M.The use of thiophanate－methyl for distinguishing between the two Phoma varieties causing gangrene of potatoes［J］.Netherlands Journal of Plant Pathology，1974，80：169－170.

［19］ Mosch W H M，Mooi J C.A chemical method to identify tuber rot in potato caused by Phoma exigua var.foveata［J］.Netherlands Journal of Plant Pathology，1975，81：86－88.

［20］ Weijman A C M，van Eijk G W，Roeijmans H J，et al.Mass spectrometric techniques as aids in the diagnosis of gangrene in potatoes caused by Phoma exigua var.foveata［J］.Netherlands Journal of Plant Pathology，1984，90：107－115.

［21］ Virgilio B，Barbara S，Stefano G，et al.Characterisation of Phoma tracheiphila by RAPD－PCR，microsatellite－primed PCR and ITS rDNA sequencing and development of specific primers for in planta PCR detection［J］.European Journal of Plant Pathology，2005，111：235－247.