王東升，黃江麗，張志紅，田曉娟，黃黃，印遇龍，丁建南＊

（1.江西省科學(xué)院生物資源研究所，江西 南昌330029；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙410125）

甲烷是主要的溫室氣體之一，其溫室效應(yīng)是二氧化碳的20～30倍。畜牧業(yè)對(duì)全球溫室效應(yīng)的貢獻(xiàn)率為9%～18%，而反芻動(dòng)物排放的甲烷約占其中80%［1］。反芻動(dòng)物通過(guò)瘤胃中微生物發(fā)酵利用纖維素、半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物，在此過(guò)程中產(chǎn)生大量氫氣和二氧化碳，而瘤胃中產(chǎn)甲烷菌利用氫氣和二氧化碳進(jìn)行還原反應(yīng)生成甲烷，甲烷再以暖氣的方式經(jīng)口排出體外。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)生成的甲烷不僅加劇了溫室效應(yīng)，同時(shí)也降低了飼料利用率，造成2%～15%飼料總能的損失［2］。因此，減少瘤胃內(nèi)甲烷的生成對(duì)提高飼料能量利用率和改善環(huán)境具有重要意義，研究調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃甲烷排放的措施和方法已成為降低溫室效應(yīng)熱點(diǎn)之一。反芻動(dòng)物瘤胃形成后通過(guò)不同措施進(jìn)行微生態(tài)調(diào)控，降低甲烷的產(chǎn)生，如羔羊28天時(shí)前胃功能發(fā)育已基本完成，此時(shí)可調(diào)控瘤胃發(fā)酵，降低甲烷排放［3］。減少甲烷排放的途徑主要有改變?nèi)占Z組成，添加脂類(lèi)物質(zhì)、抗生素和植物提取物等。研究發(fā)現(xiàn)，日糧不同精粗組合對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸、產(chǎn)氣量以及甲烷產(chǎn)生有不同影響［4，5］。添加脂類(lèi)物質(zhì)如植物油后，瘤胃pH明顯提高，瘤胃微生物活性發(fā)生變化，甲烷菌活性受到抑制，甲烷的排放減少，進(jìn)而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和飼料利用率［6］。肉牛日糧中添加葵花籽油，甲烷排放減少22%，總能損失減少21%［7］。莫能菌素是離子載體型抗生素，明顯抑制甲烷菌活性［8］，在反芻動(dòng)物上應(yīng)用降低體內(nèi)25%甲烷生成。但是，長(zhǎng)期使用莫能菌素會(huì)使瘤胃微生物產(chǎn)生適應(yīng)性，并且畜產(chǎn)品中殘留的抗生素對(duì)人體健康存在潛在威脅。因此，開(kāi)發(fā)綠色、無(wú)污染飼料添加劑越來(lái)越受到關(guān)注，其中植物提取物研究比較多。絞股藍(lán)和絲蘭等含皂甙類(lèi)植物提取物，不僅減少瘤胃中原蟲(chóng)數(shù)量，降低原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌的吞噬以及甲烷排放，而且調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式，提高飼料能量的利用效率，同時(shí)這類(lèi)物質(zhì)還有效提高動(dòng)物機(jī)體抵抗力，預(yù)防疾病發(fā)生，改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量［9，10］。

鳳仙花（Impatiens balsamina）是鳳仙花科鳳仙花屬植物，為一年生草本植物，主要分布于熱帶地區(qū)及亞熱帶地區(qū)，在中國(guó)主要產(chǎn)于西南地區(qū)［11］。鳳仙花含有豐富的化學(xué)成分，主要含有糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、醌類(lèi)、甾醇類(lèi)、香豆素類(lèi)等多種活性成分，具有抗過(guò)敏、抗真菌、抗炎等多種藥理作用［12］。本研究小組在篩選降甲烷藥用植物時(shí)發(fā)現(xiàn)，與青蒿（Artemisia annua）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、麻黃（Herba ephedrae）等植物比較，鳳仙花具有明顯的降甲烷效果［13］。試驗(yàn)采用體外厭氧培養(yǎng)技術(shù)，比較鳳仙花植株固體粉劑和乙醇浸提液對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷、微生物蛋白（MCP）、氨態(tài)氮（NH3－N）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）等發(fā)酵參數(shù)的影響，通過(guò)這些特征指標(biāo)的分析，探討鳳仙花作用機(jī)理，為以后的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 添加劑和人工飼料 降甲烷添加劑包括鳳仙花和莫能菌素。鳳仙花為本所植物遺傳育種研究室栽培，開(kāi)花后期整株采收，全株風(fēng)干后粉碎過(guò)1mm篩成為固體粉劑。固體粉劑分別在50℃、70%乙醇中浸泡48h，料液比為1∶4，浸泡之后用超聲波提取，超聲波頻率為20kHz，提取溫度為50℃。通過(guò)抽濾得到粗提液，在60℃左右將粗提液濃縮到總體積的1／5，即為鳳仙花乙醇浸提液。莫能菌素是40%預(yù)混劑，購(gòu)自江西省南昌市獸醫(yī)防疫站。人工飼料選用黃豆粒、玉米粒和稻草，分別將這3種材料粉碎后過(guò)1mm篩備用。

1.1.2 瘤胃液采集 瘤胃液取自裝有永久瘤胃瘺管的黃牛，試驗(yàn)動(dòng)物每天飼喂2次，飼喂時(shí)間點(diǎn)為7：00和17：00，自由飲水。2011年5－6月份取樣試驗(yàn)。晨飼2h后采集瘤胃瘺管中新鮮瘤胃液，迅速裝入充有氮?dú)庾苑獯?，并?9℃保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集的瘤胃液用4層脫脂紗布在大燒杯中過(guò)濾，過(guò)濾時(shí)在厭氧袋中操作，減少微生物與空氣的接觸。量取所需體積瘤胃液迅速加入到準(zhǔn)備好的人工唾液中（瘤胃液與人工唾液體積比為1∶2），制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液，人工瘤胃培養(yǎng)液在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前新鮮配制。人工唾液由微量元素溶液、緩沖液、常量元素溶液和還原劑溶液等組成，具體配制參照Menke和Steingass［14］的方法。

1.1.3 瘤胃體外培養(yǎng)裝置 本研究使用的體外厭氧瘤胃培養(yǎng)裝置是在王全軍等［15］所用培養(yǎng)裝置基礎(chǔ)上改造而成，裝置由兩部分組成，培養(yǎng)瓶和50mL玻璃注射器（浙江寧波和平注射器廠(chǎng)），兩者之間通過(guò)帶控制閥的軟管連接。培養(yǎng)瓶中放入人工瘤胃培養(yǎng)液和飼料，瓶口用反口膠塞密封。在膠塞上插入軟管的尖頭部分，軟管末端連接注射器。用密封帶和膠布密封并固定軟管的尖頭部分，注射器用橡皮筋固定在培養(yǎng)瓶外。注射器每次使用之前用凡士林涂抹注射器，消除注射器內(nèi)腔和塞之間摩擦。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用二因子設(shè)計(jì)，因子1為鳳仙花固體粉劑和乙醇提取物，因子2為添加劑的添加量，添加量設(shè)3個(gè)梯度，鳳仙花乙醇浸提液添加量分別是培養(yǎng)液體積的0.5%，1.0%和2.5%（mL／mL，E1、E2和E3）；固體粉劑添加量分別是培養(yǎng)液體積的0.5%，1.0%和2.5%（g／mL，S1、S2和S3）。試驗(yàn)設(shè)正負(fù)對(duì)照，負(fù)對(duì)照為無(wú)任何添加劑（CK）；正對(duì)照為莫能菌素，添加量為30mg／L（M），莫能菌素添加量參考相關(guān)文獻(xiàn)［16］。每一處理設(shè)7個(gè)平行，每個(gè)培養(yǎng)瓶為一平行，試驗(yàn)連續(xù)重復(fù)4批次。

1.2.2 體外培養(yǎng) 分別稱(chēng)取稻草粉、玉米粉和黃豆粉0.90g，0.45g和0.15g，組成體外厭氧培養(yǎng)所用人工飼料。將人工飼料送入250mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，按照處理加入不同添加劑。在厭氧操作袋中打開(kāi)培養(yǎng)瓶，分別向每個(gè)瓶中加入人工瘤胃培養(yǎng)液200mL，與人工飼料混合均勻。迅速蓋上膠塞，插上軟管的尖頭部分，打開(kāi)軟管的控制閥，用針頭導(dǎo)入高純氮?dú)?，?qū)趕瓶中剩余空氣，確保培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)為厭氧環(huán)境。將培養(yǎng)瓶放入（39±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)。在12，18和24h記錄注射器讀數(shù)，測(cè)定注射器內(nèi)甲烷（CH4）和二氧化碳（CO2）含量。各個(gè)處理的注射器讀數(shù)與校正對(duì)照比較后 （只有培養(yǎng)液沒(méi)有飼料底物），轉(zhuǎn)變成產(chǎn)氣量。公式為：產(chǎn)氣量＝Vt－Vi，其中，Vt為各處理發(fā)酵t小時(shí)的注射器讀數(shù)，Vi為校正對(duì)照發(fā)酵t小時(shí)的注射器讀數(shù)。發(fā)酵至終點(diǎn)后收集各處理發(fā)酵液，測(cè)定pH、氨態(tài)氮（NH3－N）、微生物蛋白（MCP）和3種揮發(fā)性脂肪酸（VFA）。

1.2.3 測(cè)定方法 CO2和CH4測(cè)定：CO2含量用GASBOARD沼氣分析儀（武漢四方光電科技有限公司）測(cè)定；CH4用島津氣相色譜儀器測(cè)定，測(cè)定條件為：HP－INNOWAX（19091N－133）毛細(xì)管柱，測(cè)定條件為柱溫80℃，氣化室溫度100℃，檢測(cè)室溫度120℃，載氣使用高純氮?dú)?。?0μL微量注射器分別抽取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0μL甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣，根據(jù)甲烷濃度和其峰面積關(guān)系，確定甲烷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，具體條件參照胡偉蓮等［17］方法。

發(fā)酵液參數(shù)測(cè)定：發(fā)酵液pH值用梅特勒－托利多酸度計(jì)直接測(cè)定；NH3－N含量測(cè)定采用水楊酸鈉－次氯酸鈉比色法，具體過(guò)程參照馮宗慈和高民［18］的方法；MCP含量測(cè)定參照Makkar等［19］分步離心法進(jìn)行樣品的預(yù)處理，考馬斯亮藍(lán)（G250）比色法測(cè)定蛋白含量。測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸含量時(shí)，取培養(yǎng)液1mL，加0.2mL濃度為25%的偏磷酸，4℃高速離心（12 000r／min）10min，測(cè)定上清液中3種VFA含量。配制6個(gè)梯度的乙酸、丙酸和丁酸的混合標(biāo)樣，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。氣相色譜測(cè)定的柱溫為180℃，氣化室溫度為200℃，檢測(cè)室溫度為220℃，具體條件參照相關(guān)文獻(xiàn)［17］。培養(yǎng)液中VFA主要由乙酸、丙酸和丁酸組成，三者之和為總揮發(fā)酸（TVFA）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行記錄整理，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SAS V8軟件的Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳仙花對(duì)產(chǎn)氣量的影響

比較不同處理體外培養(yǎng)中的產(chǎn)氣量（表1），12h測(cè)定結(jié)果中，莫能菌素（M）處理的產(chǎn)氣量最低，比對(duì)照（CK）顯著低56.9%，所有鳳仙花處理產(chǎn)氣量高于CK，鳳仙花固體粉劑高濃度處理（S3）比CK高86.9%，同時(shí)也顯著高于其他鳳仙花處理（P＜0.05）。18h產(chǎn)氣量中，莫能菌素處理產(chǎn)氣量也是最低，固體粉劑3個(gè)添加量S1、S2和S3均顯著高于鳳仙花乙醇浸提液3個(gè)處理（P＜0.05）。24h培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，莫能菌素處理依然保持最低，S3處理最高，所有鳳仙花處理均顯著高于CK和莫能菌素處理（P＜0.05）。比較各處理3次總產(chǎn)氣量，鳳仙花固體粉劑最高，3個(gè)添加量分別比CK高42.4%，57.0%和70.9%，乙醇浸提液3個(gè)添加量分別比CK高16.6%，25.2%和32.2%，莫能菌素處理比CK顯著低27.8%（P＜0.05）。因此，鳳仙花與莫能菌素處理對(duì)產(chǎn)氣量的影響結(jié)果相反。鳳仙花2種制劑添加量和產(chǎn)氣量之間表現(xiàn)出一定正比關(guān)系，添加量低，產(chǎn)氣量低，添加量高，產(chǎn)氣量也相應(yīng)提高。

表1 鳳仙花乙醇浸提液和固體粉劑對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣的影響Table 1 Effects of ethanol extract and plant solid powder of I.balsaminaon gas production in vitro rumen fermentation

2.2 鳳仙花對(duì)CH4和CO2的影響

比較12hCH4差異（表1），含量最高是CK，莫能菌素處理明顯較低，比CK顯著低89.7% （P＜0.05）。鳳仙花固體粉劑3個(gè)處理都為0；乙醇浸提液3個(gè)處理分別比CK顯著低85.3%，83.8%和95.6% （P＜0.05）。分析18和24h測(cè)定結(jié)果，CK中CH4含量在所有處理中保持最高，莫能菌素顯著低于CK（P＜0.05），分別比CK低84.9%和74.3%。鳳仙花固體粉劑S3處理抑制CH4生成，2個(gè)較低添加濃度處理中僅有微量CH4；乙醇浸提液3個(gè)添加量18h測(cè)定結(jié)果比CK分別低72.3%，85.6%和97.9%，24h測(cè)定結(jié)果比CK低32.8%，77.1%和98.0%（P＜0.05）。

CO2變化與CH4相反，與產(chǎn)氣量變化趨勢(shì)相似。不同時(shí)間取樣測(cè)定結(jié)果中，莫能菌素處理均為最低，平均比CK低22.6%。在鳳仙花2種制劑中，固體粉劑對(duì)CO2提高明顯，各添加量平均比CK高109.5%，54.5%和89.6% （P＜0.05），乙醇浸提液各添加量分別比CK 高31.8%，44.8%和70.5%。

2.3 鳳仙花對(duì)pH的影響

發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，測(cè)定瘤胃液中的pH，比較所有處理，莫能菌素最高（表2），比CK高0.2%（P＞0.05）；鳳仙花處理均比CK低，并且隨著添加量的提高，降低更明顯。鳳仙花乙醇浸提液3個(gè)添加量分別比CK低1.9%，2.8%和4.7%，固體粉劑處理分別比CK低3.5%，5.4%和8.4%（P＜0.05）。

表2 鳳仙花乙醇浸提液和固體粉劑體外發(fā)酵代謝參數(shù)的影響Table 2 Effects of ethanol extract and plant solid powder of I.balsaminaon metabolic parameters in vitro rumen fermentation

2.4 鳳仙花對(duì)MCP和NH3－N的影響

NH3－N和MCP是瘤胃微生物發(fā)酵2個(gè)重要指標(biāo)，反映了瘤胃代謝狀態(tài)。結(jié)果顯示（表2），CK中NH3－N含量最高，其他處理均顯著低于CK（P＜0.05），莫能菌素處理比CK低16.3%，乙醇浸提液3個(gè)處理比CK低12.8%，29.7%和48.2%，固體粉劑3個(gè)處理比CK低41.1%，52.2%和55.4%。添加量相同時(shí)，鳳仙花固體粉劑降低效果比乙醇浸提液明顯。體外發(fā)酵液中MCP結(jié)果與NH3－N不同，莫能菌素處理的MCP最低，比CK低1.8%（P＞0.05），鳳仙花處理的 MCP均高于CK，固體粉劑3個(gè)添加量分別比CK高84.9%，139.7%和199.7%（P＜0.05），乙醇浸提液分別比CK高60.0%，77.4%和94.8%。

2.5 鳳仙花對(duì)VFA的影響

比較各處理乙酸含量（表2），莫能菌素處理最低，比CK低3.6%（P＞0.05）；鳳仙花處理平均比CK高14.9%，比莫能菌素處理高19.3%。鳳仙花處理之間沒(méi)有明顯區(qū)別，但是2種處理方式表現(xiàn)為先升高后降低趨勢(shì)，與其他發(fā)酵參數(shù)變化規(guī)律不同。比較丙酸差異，CK含量最低，莫能菌素處理比CK高11.5%（P＞0.05）；鳳仙花固體粉劑平均比CK高33.7%（P＜0.05），乙醇浸提液平均比CK高21.4%。結(jié)果中看出，丁酸在3種揮發(fā)性脂肪酸中所占比例最小，莫能菌素處理的丁酸含量最低，比CK低2.3%（P＞0.05）；固體粉劑平均比CK高12.2%，乙醇浸提液平均比CK高10.7%。比較3種揮發(fā)性脂肪酸總量（TVFA），莫能菌素處理最低，比CK低1.4%（P＞0.05）；固體粉劑比CK平均高20.2%，乙醇浸提液比CK平均高12.9%。對(duì)于乙酸／丙酸，CK最高，莫能菌素處理比CK低13.5%（P＜0.05），鳳仙花固體粉劑比CK平均低11.45%，乙醇浸提液比CK低8.1%。本試驗(yàn)中，鳳仙花處理不同程度提高瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸含量，TVFA也隨著3種酸含量的提高而提高，降低乙酸／丙酸。

3 討論

莫能菌素（Monensin）是反芻動(dòng)物應(yīng)用較廣的飼料添加劑，具有減少瘤胃甲烷生成、提高飼料轉(zhuǎn)化效率功效。莫能菌素在一定用量?jī)?nèi)對(duì)產(chǎn)氣總量影響不明顯，但是明顯提高二氧化碳含量［16，20］。本試驗(yàn)中，莫能菌素用量在30mg／L時(shí)，CH4降低，產(chǎn)氣量和CO2也下降，分析認(rèn)為與用量較多有關(guān)。鳳仙花不同添加量明顯降低CH4含量，劑量越高效果越明顯。研究表明，飼料有機(jī)物質(zhì)的消化率與體外培養(yǎng)時(shí)的產(chǎn)氣量具有高度相關(guān)性，產(chǎn)氣量越高，表明飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵活動(dòng)越劇烈［21］。鳳仙花明顯提高產(chǎn)氣量和CO2含量，表明添加的鳳仙花刺激了瘤胃微生物代謝活動(dòng)，提高某些微生物活性；另外，當(dāng)CH4生成受到抑制時(shí)，造成CO2和H2等累積［22］。

MCP代謝是瘤胃微生物區(qū)系營(yíng)養(yǎng)代謝的一個(gè)重要的組成部分，是反芻動(dòng)物最主要的氮源供應(yīng)者［23］。本試驗(yàn)中，體外培養(yǎng)24h后，鳳仙花處理MCP測(cè)定結(jié)果均比CK高。試驗(yàn)結(jié)果表明，鳳仙花處理刺激了瘤胃微生物代謝活動(dòng)，加快瘤胃微生物蛋白合成，促進(jìn)NH3－N向MCP轉(zhuǎn)化。此結(jié)果與茶皂素等植物提取物具有減少瘤胃NH3－N濃度、促進(jìn)MCP合成結(jié)論一致［24］。添加莫能菌素降低MCP含量，與莫能菌素抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌活性、引起瘤胃細(xì)菌數(shù)量下降等有關(guān)［8］。瘤胃液pH值是反映瘤胃內(nèi)發(fā)酵狀況的一項(xiàng)綜合指標(biāo)，pH值過(guò)高或過(guò)低對(duì)瘤胃微生物生長(zhǎng)、發(fā)育及發(fā)酵均有不利的影響［25］。本試驗(yàn)中，莫能菌素pH比CK高0.2%，差異不顯著，添加鳳仙花引起pH值明顯降低，分析原因可能是鳳仙花處理影響瘤胃微生物菌群，提高了揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量。pH變化與飼料配比有關(guān)［26］，本研究中飼料配比對(duì)鳳仙花引起的pH變化緩沖效果差，在以后研究中需要調(diào)整飼料組成和配比。另外，由于試驗(yàn)采用不連續(xù)體外發(fā)酵，不能及時(shí)排除代謝產(chǎn)物而造成大量有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)累積［27］。有文獻(xiàn)報(bào)道VFA是反芻動(dòng)物和瘤胃微生物維持和生長(zhǎng)的主要能量來(lái)源，瘤胃內(nèi)各VFA百分率反映瘤胃微生物的發(fā)酵類(lèi)型及養(yǎng)分吸收情況［28］。鳳仙花處理提高瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸含量，TVFA也隨著提高，而乙酸／丙酸下降，可能是鳳仙花不僅促進(jìn)飼料能量的利用，而且還改變了瘤胃代謝模式，結(jié)果與茶皂甙和延胡索酸二鈉效果相同［29，30］。

比較鳳仙花乙醇浸提液以及固體粉劑體外瘤胃發(fā)酵效果，從CH4、CO2和MCP等數(shù)據(jù)看，濃度相同時(shí)，固體粉劑的效果最好，乙醇浸提液效果較差。當(dāng)直接添加固體粉劑時(shí)，其中含有的少量對(duì)多糖、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也被微生物利用，促進(jìn)瘤胃微生物發(fā)酵，所以效果更明顯。

4 結(jié)論

鳳仙花乙醇浸提液和固體粉劑均能有效降低CH4產(chǎn)生，促進(jìn)NH3－N向MCP轉(zhuǎn)化，添加量高時(shí)（2.5%）效果更明顯，固體粉劑的效果最好，并且用量較大時(shí)，沒(méi)有副作用。綜上所述，鳳仙花有望成為反芻動(dòng)物新型瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑。

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