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        耐藥性木霉T2菌株的篩選、紫外誘變與藥劑馴化

        2013-08-20 04:07:38尹婷徐秉良梁巧蘭古麗君李榮峰
        草業(yè)學報 2013年2期
        關鍵詞:木霉孢菌抗藥性

        尹婷,徐秉良,梁巧蘭,古麗君,李榮峰

        (甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 甘肅省草業(yè)工程實驗室中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州730070)

        木霉(Trichodermaspp.)作為一類重要的生防真菌,廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面等生態(tài)環(huán)境中[1],具有適應性強,存在范圍廣和廣譜、高效等優(yōu)點。但目前單獨使用生防因子來控制作物病害,往往受到環(huán)境條件等因素的干擾,造成田間防治效果不穩(wěn)定[2],因此生產(chǎn)上常與殺菌劑混合使用,然而,木霉菌對化學藥劑較為敏感,限制了其使用范圍和防治效果。因此,深入研究、開發(fā)和生產(chǎn)優(yōu)良木霉菌及進行木霉菌株的耐藥性研究,對防治植物真菌病害,促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。近年來,殺菌劑,特別是高效、內(nèi)吸、專一性殺菌劑得到了廣泛應用[3],雖然化學農(nóng)藥見效快,防效高,但是它的長期使用會給人類健康帶來嚴重隱患,并且造成生態(tài)環(huán)境失衡,引發(fā)有害生物產(chǎn)生抗藥性,導致其他有益生物數(shù)量下降、人畜中毒,不利于綠色植保事業(yè)的發(fā)展[4,5]。隨著人類對生態(tài)環(huán)境及綠色食品的重視,促使人們開展多方面研究以開發(fā)高效、低毒、低殘留及與環(huán)境和諧的生態(tài)合理農(nóng)藥[6]。目前,國內(nèi)對抗真菌藥物耐藥機制的研究和抗真菌藥物的耐藥性研究取得了一定的進展,有關木霉耐藥性的報道也越來越多。王勇等[2]通過含藥培養(yǎng)基的篩選,得到了速克靈抗性拮抗木霉菌株,二者協(xié)同使用比單獨使用可以更好地防治灰霉病,并研究了最佳配比。為了獲得優(yōu)良的耐藥性木霉菌株,需要對野生菌株加以改良。目前的菌株改良手段主要有誘變育種、原生質(zhì)體融合和遺傳改造[7-9]。但直到20世紀80年代,誘變育種技術才真正用于木霉研究[10],其中,紫外線誘導是一種簡便、實用、應用廣泛的菌種改良方法。丁中等[11]通過紫外光照射結合使用含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)得到了3個哈茨木霉腐霉利抗性突變菌株,抗性菌株與親本菌株相比較,其抗藥性提高100倍以上。魯海菊等[12]用紫外誘變哈茨木霉,通過多菌靈耐藥性篩選,獲得耐藥性菌株,為進一步篩選強根際能力木霉菌株提供了優(yōu)質(zhì)材料。田連生等[13]也篩選出對化學殺菌劑腐霉利(商品名稱速克靈)有顯著抗性的突變性霉菌株UT-4。本研究擬通過耐藥性測定和紫外光誘變及藥劑馴化培養(yǎng),以期篩選出能夠與殺菌劑混合的木霉菌株。

        1 材料與方法

        1.1 供試菌株

        深綠木霉(T.aureoviride)T2菌株和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物病理學實驗室提供。

        1.2 供試藥劑

        供試藥劑6種,分別是75%百菌清可濕性粉劑(上海亞泰農(nóng)資有限公司生產(chǎn))、80%多菌靈可濕性粉劑(河北益海安格諾農(nóng)化有限公司生產(chǎn))、15%三唑酮可濕性粉劑(江蘇劍牌農(nóng)藥化工有限公司生產(chǎn))、65%代森錳鋅可濕性粉劑(成都皇牌作物科學有限公司生產(chǎn))、50%速克靈可濕性粉劑(甘肅農(nóng)科院植保所新農(nóng)藥開發(fā)中心生產(chǎn))和50%撲海因可濕性粉劑(拜耳作物科學公司生產(chǎn))。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 耐藥性測定 試驗于2010年7月實施,重復進行3次。采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)方法[14]。稱取各供試藥劑,加無菌水,配成濃度分別為2.5,5.0,10.0,20.0,40.0mg/mL的母液。PDA 培養(yǎng)基(每三角瓶49mL)冷卻到50℃左右時,分別加入1mL上述濃度的母液,使含藥培養(yǎng)基的最終含藥濃度分別達到50,100,200,400,800 μg/mL,充分搖勻后,均勻倒入3個培養(yǎng)皿中制成平板。再用打孔器切取直徑為6mm的深綠木霉T2菌塊,移植于含藥平板中央,每處理重復3次。將各處理置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60h,測量菌落直徑。以加入等量無菌水制成的PDA平板為對照。用如下公式計算抑菌率:

        以藥劑有效成分濃度對數(shù)值為自變量(x),相對抑制率的機率值為因變量(y),計算出毒力回歸方程式和相關系數(shù)。由毒力回歸方程,令y=5(即抑制50%的機率值),反常用對數(shù)x即為EC50值。

        1.3.2 紫外光誘導 在深綠木霉T2菌株培養(yǎng)物上用直徑6mm的打孔器打孔,將菌餅接到PDA平板培養(yǎng)基上,在25℃下恒溫培養(yǎng)7d,加無菌水用無菌毛筆輕輕洗刷,用無菌紗布過濾除去菌絲得孢子懸浮液。用血球計數(shù)板測定孢子濃度,使其達到1×108個孢子/mL。將此懸浮液0.1mL,均勻涂布于PDA平板上[10],置于超凈工作臺上10W紫外燈管下60cm處(不加蓋),用黑布遮住超凈工作臺,避開外界光進行照射。設0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0h共6個照射時間處理。處理后立即用黑紙把平板包好,并放入25℃的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)[15],5d后統(tǒng)計平板上生長菌落數(shù)。以不經(jīng)過紫外光照射的PDA平板為對照。

        1.3.3 藥劑馴化 將以上培養(yǎng)5d后在PDA平板上生長的菌落打孔,取直徑6mm菌餅轉(zhuǎn)移到含速克靈濃度為50μg/mL的含藥平板上培養(yǎng)。5d后選取生長最快菌落,在邊緣打孔,取直徑6mm菌餅接種在速克靈濃度為100μg/mL的含藥平板上,在25℃恒溫培養(yǎng)。5d后再次選擇生長最快的菌落,取直徑6mm的菌餅接種在速克靈濃度為200μg/mL的PDA平板上[16]。用此方法,將在速克靈濃度400和800μg/mL上測試,最終選擇出生長最快的菌落。

        1.3.4 抗藥穩(wěn)定性測定 將篩選出的抗藥性木霉菌株分別接種在PDA平板上,于25℃恒溫培養(yǎng),每7d轉(zhuǎn)接1次,連續(xù)轉(zhuǎn)接10次[17]。再在速克靈濃度為800μg/mL的PDA平板上培養(yǎng),測量60h時菌落直徑,以原始菌株為對照,計算速克靈對選出菌株的生長抑制率。每處理重復3次。

        1.3.5 生長速率及產(chǎn)孢能力測定 將各抗藥性木霉菌株取直徑6mm的菌塊接種于PDA平板上,在25℃下恒溫培養(yǎng),每天測量菌落直徑1次,連續(xù)測量3d,計算各抗藥性木霉菌株的生長速率;培養(yǎng)7d后取10mL無菌水沖洗培養(yǎng)物表面,得到孢子懸浮液。取該懸浮液1mL加入盛有99mL無菌水的三角瓶中,在轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床上振蕩20min,使孢子在無菌水中分散均勻,用血球計數(shù)板測產(chǎn)孢濃度[17]。以上每處理均為3次重復。

        1.3.6 對灰葡萄孢菌的拮抗作用測定 將木霉親本菌株和各抗藥性菌株分別與灰葡萄孢菌對峙接種于PDA平板,菌塊直徑6mm,兩接菌點相距40mm。同時,單獨接種木霉菌灰葡萄孢菌做對照。每處理重復3次,于25℃下培養(yǎng),并測量對照灰葡萄孢菌直徑和灰葡萄孢菌菌落中心到木霉菌菌落邊緣的距離,計算各木霉菌株對灰葡萄孢菌的抑菌率,統(tǒng)計拮抗系數(shù),并篩選出拮抗性最強的菌株。

        計算抑菌率采用以下公式:I=100-(R2/R1)×100%[18]。式中,I為木霉菌的抑菌率,R1為對照灰葡萄孢菌直徑,R2為灰葡萄孢菌菌落中心到木霉菌菌落邊緣的距離。

        拮抗系數(shù)分級標準(5級)[19]:Ⅰ級:深綠木霉菌絲面積≥100%平皿面積;Ⅱ級:深綠木霉菌絲面積≥67%平皿面積;Ⅲ級:33%平皿面積<深綠木霉菌絲面積<67%平皿面積;Ⅳ級:深綠木霉菌絲面積≤33%平皿面積;Ⅴ級:病原菌菌絲面積≥100%平皿面積。

        2 結果與分析

        2.1 耐藥性測定

        深綠木霉T2菌株在含不同殺菌劑的培養(yǎng)基上生長情況詳見表1。深綠木霉T2菌株對不同殺菌劑耐藥性不同,殺菌劑對木霉菌的抑制作用隨藥劑施用濃度的增大而逐漸增強。接種培養(yǎng)60h后發(fā)現(xiàn),深綠木霉T2菌株對百菌清、多菌靈、三唑酮、代森錳鋅、速克靈和撲海因的耐藥性順序由強到弱分別是代森錳鋅、三唑酮、百菌清、多菌靈、撲海因、速克靈,EC50分別為221.14,171.12,150.90,123.24,42.12和26.24μg/mL。

        2.2 紫外光誘變選育

        紫外光處理對木霉分生孢子有一定的致死作用,但不同照射時間均能有一定數(shù)量的孢子存活。其中照射0.5 h平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)最多,共產(chǎn)生5個;照射3.0h平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)最少,共產(chǎn)生2個;照射1.0和1.5h平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)均為4個;照射2.0和2.5h平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)均為3個。

        表1 深綠木霉T2菌株對6種殺菌劑的耐藥性測定Table 1 Endurance of T.aureoviride T2against 6kinds of fungicides

        2.3 藥劑馴化培養(yǎng)

        將上述紫外光誘導得到6株突變型菌株,分別標記為T2-1~T2-6。根據(jù)測量的各菌落直徑,計算生長抑制率。結果表明,親本菌株T2在含速克靈的培養(yǎng)基上基本不生長,其受抑制率為91.58%,而6個突變型菌株分別為20.75%,24.83%,15.76%和12.41%。其中T2-6受速克靈的影響很小。速克靈對其他突變型菌株 T2-3、T2-4的抑制率較高,分別達到62.34%和70.18%。因此篩選出4株對速克靈抗性較好的突變型菌株T2-1、T2-2、T2-5和 T2-6。

        2.4 抗藥穩(wěn)定性

        將上述篩選出的抗藥性木霉菌株T2-1、T2-2、T2-5和T2-6連續(xù)10次轉(zhuǎn)接后發(fā)現(xiàn),速克靈對各抗藥性木霉菌株生長抑制率的變化都不是很大,表明突變菌株的抗藥性沒有隨著傳代培養(yǎng)而消失。其中T2-6菌株的抗藥特性更加穩(wěn)定,基本未發(fā)生變化(表2)。

        表2 速克靈對轉(zhuǎn)接后各抗藥性木霉菌株的生長抑制率測定Table 2 Growth inhibition rate of Procymidone on each antagonistic Trichodermastrains after inoculation %

        2.5 生長速率和產(chǎn)孢能力

        從菌絲的生長速率來看,T2-6菌株的平均生長速率最快,明顯高于親本菌株T2和其他3個抗藥菌株,T2-5菌株與親本菌株接近,T2-1和T2-2菌株均低于親本菌株;在產(chǎn)孢量上,T2-6菌株的產(chǎn)孢量同樣明顯高于親本菌株T2和其他3個抗性菌株,親本菌株的產(chǎn)孢量高于其他3個抗藥菌株(表3)。

        表3 抗藥性木霉菌株的生長速率和產(chǎn)孢能力Table 3 Growth rate and ability of producing spores of antagonistic Trichodermastrains

        2.6 抗性木霉菌株對灰葡萄孢菌的拮抗作用

        各抗性菌株和親本菌株對灰葡萄孢菌都有強烈的拮抗作用。各個木霉菌株和灰葡萄孢菌先在平板兩邊各自生長,48h后兩菌落邊緣接觸,木霉菌對灰葡萄孢菌產(chǎn)生抑制作用,使其生長速率減緩直至停止??剐跃闠2-6對灰葡萄孢菌的抑制率最高,達到93.26%,T2-5菌株和親本菌株抑制率相近,僅相差1.31%,T2-2菌株對灰葡萄孢菌的抑制率最低,為82.75%(圖1)。T2-1、T2-2菌株對灰葡萄孢菌的平菌抑菌率與親本菌株的抑菌率差異顯著,T2-5和T2-6菌株對灰葡萄孢菌的抑菌率差異不顯著,T2-1、T2-2和T2-5菌株對灰葡萄孢菌的抑菌率差異不顯著,T2-6菌株與T2-1、T2-2菌株對灰葡萄孢菌的抑菌率差異顯著。抗性菌株T2-5、T2-6和親本菌株的拮抗系數(shù)均為Ⅱ,T2-1和T2-2菌株的拮抗系數(shù)為Ⅳ。通過對以上試驗結果的綜合分析,最后篩選出突變型木霉菌株T2-6為最佳抗藥性菌株(表4)。

        3 討論與結論

        6種殺菌劑對深綠木霉的生長均有一定的抑制作用,且隨著藥劑濃度的增加,抑制作用越明顯;不同的藥劑對木霉的抑制力不同,其中代森錳鋅的抑制力最低,速克靈的抑制力最高;通過對深綠木霉T2菌株的紫外線誘變處理和含藥平板馴化培養(yǎng),成功篩選出了對速克靈產(chǎn)生高度抗性的突變型菌株。紫外線作為一種物理誘變因子,具有誘變效果明顯和方法簡單等優(yōu)點,是誘導微生物突變的一種非常有用的工具,通過擴大突變體的篩選基數(shù),可得到性能優(yōu)良的變異菌株[20]。Papvizas[21,22]以苯菌靈為敏感性標記物,采用紫外線誘變對哈茨木霉(T.harzianum)和綠色木霉(T.viride)進行誘變,得到了對苯菌靈有耐藥性的菌株,這些變異菌株的生長特性,產(chǎn)孢量以及抗菌能力同親本菌株相比都有顯著改善。楊合同等[10]通過紫外線誘變處理,獲得了對多菌靈具有抗性的突變菌株,該突變株在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20代后,其抗藥性、生長速度都沒有改變,表現(xiàn)非常穩(wěn)定。本試驗發(fā)現(xiàn)深綠木霉菌株T2-6,該突變型菌株的生長速率、產(chǎn)孢量以及拮抗作用與親本菌株相近,而抗藥性卻遠遠高于親本菌株,連續(xù)轉(zhuǎn)接10代,其抗藥性隨傳代仍然表現(xiàn)穩(wěn)定。

        木霉菌適應環(huán)境的一個重要方面就是對化學農(nóng)藥的抗性,解決了這個問題,才能保證木霉菌在生防中發(fā)揮更好的作用,能夠最大限度地發(fā)揮生物農(nóng)藥的作用,減少化學農(nóng)藥的使用,提高木霉菌制劑對作物病害的防治效果[23,24]。

        由于木霉菌在PDA平板的培養(yǎng)是無性繁殖,這種由微效多基因控制的抗性似能穩(wěn)定遺傳[18],這在本試驗中也得到了證明。但是木霉菌在自然條件下存在準性生殖,其抗藥性是否能夠穩(wěn)定遺傳,還需進一步證明。同時生防制劑的應用還受到溫度、濕度、光照等各種因素的影響,獲得的抗性菌株與速克靈如何混合、混合使用后的田間防治效果等問題本試驗尚未涉及,還有待進一步的研究。

        表4 抗藥性木霉菌株對灰葡萄孢菌的拮抗作用Table 4 Antagonism of antagonistic Trichoderma strains to Botrytis cinerea

        圖1 抗藥性木霉菌株對灰葡萄孢菌的拮抗作用Fig.1 Antagonism of antagonistic Trichoderma strains to Botrytis cinerea

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