張 毅 苗 玲 蘇 敏 蔡 琰

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 上海 200127

本文進一步分析硫辛酸對內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的影響，以探討硫辛酸抗氧化、保護神經(jīng)細胞的機制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑和設備 硫辛酸（純品原料）有上?，F(xiàn)代制藥有限公司提供，所用細胞株是美國新墨西哥洲洲立大學Davise教授饋贈的小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞A2（NBA2）。高糖改良 Eagle培養(yǎng)基（DMEM）、0．25%胰蛋白酶（含 EDTA）、磷酸緩沖液（PBS）為美國invitrogen公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白、胰島素是Sigma公司產(chǎn)品；DMSO是AMRESCO公司產(chǎn)品；MTT和小牛血清購自上海華美生物公司；GSH分析試劑和考馬斯亮藍蛋白測定試劑購自南京建成生物工程有限公司。CO2細胞培養(yǎng)箱：TABAI MFG．有限公司（日本）；超凈工作臺：蘇州凈化設備廠（中國）；Nicon倒置相差顯微鏡：Nicon公司（日本）；Bio－Rad 680酶標儀：Bio－Rad公司（美國）；7200分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司（中國）。

1．2 培養(yǎng)液準備 牛血清培養(yǎng)液（BD）：DMEM中含小牛血清10%，pH 7．2，無血清培養(yǎng)液（AI）：DMEM 中含500mg牛血清白蛋白和5mg胰島素，pH 7．2。含硫辛酸培養(yǎng)液（LA）：在AI中加入硫辛酸，配制成含100μmol／L硫辛酸的無血清培養(yǎng)液。

1．3 細胞培養(yǎng) 依據(jù)實驗性神經(jīng)細胞老化模型建立方法［1］，采用無血清培養(yǎng)液（AI）在96孔培養(yǎng)板和25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)NBA2細胞。設立硫辛酸實驗組（LA組）和無血清對照組（AI組），LA組培養(yǎng)液為含100μmol／L硫辛酸的AI培養(yǎng)液，2組均設5d、10d和15d時間組；細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．4 用MTT法檢測神經(jīng)細胞存活數(shù) 接種在96孔板中各組細胞（1．0×104個／孔）培養(yǎng)至5d、10d和15d時同時終止培養(yǎng)，各孔中加入新鮮配制的5mg／mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，然后去除溶液，每孔中加入150μL DMSO，震蕩10min溶解結晶，最后在酶標儀上用570nm波長測定各孔的吸光度，吸光度的大小反映了存活的細胞數(shù)量。以5d對照組為標準，細胞存活率定為100%，其他各組吸光度與之相比，得到細胞相對存活率。每組重復8次，取平均值。

1．5 測定GSH含量 接種于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中細胞（7×105個／瓶）在培養(yǎng)至5d、10d和15d時終止培養(yǎng)，各組細胞用0．25%胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，PBS洗滌2次，3次凍融破碎細胞，取各組細胞上清液用比色法測定并計算GSH含量（具體操作按照試劑盒說明書），各組均重復5次，取平均值，同時用考馬斯亮藍法測定蛋白含量（按試劑盒說明操作）。

1．6 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 11．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，進行ANOVA分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 硫辛酸對老化的實驗性神經(jīng)細胞存活率的影響 100 μmol／L LA實驗組和AI對照組細胞存活率見表1。

2．2 硫辛酸對實驗性神經(jīng)細胞內(nèi)GSH水平的干預 各組細胞內(nèi)GSH含量見表2。

表1 硫辛酸對神經(jīng)細胞老化過程中細胞存活率的影響 （n＝8，±s，%）

表1 硫辛酸對神經(jīng)細胞老化過程中細胞存活率的影響 （n＝8，±s，%）

注：與同時期對照組比較，＊P＜0．05

組別5d 10d 15d AI對照組100．00±14．79 75．45±10．78 28．54±3．13 LA組 212．48±12．22＊ 200．55±28．29＊ 96．81±14．46＊

表2 硫辛酸對神經(jīng)細胞老化過程中細胞內(nèi)GSH水平的影響 （重復次數(shù)n＝5，xˉ±s）

3 討論

谷胱甘肽（GSH）和超氧化歧化酶（SOD）是細胞內(nèi)重要的清除自由基、抗氧化損傷的物質(zhì)，SOD能促使超氧陰子自由基變?yōu)檠醴肿雍瓦^氧化氫，并通過其他酶系的進一步作用而清除，抵抗膜脂質(zhì)過氧化作用，保護細胞免受氧化損害。GSH是細胞內(nèi)一種低分子量硫醇抗氧化劑，主要通過兩種ATP依賴酶（γ－谷氨酰胱氨酸連接酶，GSH合成酶）合成，作為重要的內(nèi)源性抗氧化劑，在清除過多ROS，保護細胞對抗氧化損傷方面起關鍵作用。這些內(nèi)源性抗氧化劑反映了細胞自身的抗氧化能力。

我們以往研究結果提示，硫辛酸對神經(jīng)細胞具有保護作用，能夠減少老化細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化損傷；在抗氧化分析中，雖然發(fā)現(xiàn)對SOD活性有一定的提升作用，但是其對SOD的作用并不顯著［2］。本文繼續(xù)采用已建立的神經(jīng)細胞老化模型，進一步分析硫辛酸對細胞內(nèi)源性抗氧化劑GSH的作用。結果顯示，盡管老化過程中GSH水平也明顯下降，但是與對照組比較，硫辛酸能顯著提高細胞內(nèi)還原型谷胱苷肽水平。結果說明硫辛酸具有促進細胞內(nèi)源性抗氧化劑GSH水平提高的作用。我們已經(jīng)知道硫辛酸自身具有超強的抗氧化能力，是許多其他抗氧化劑所不能及的［3－4］。我們的結果提示硫辛酸可能通過直接清除ROS和調(diào)動細胞內(nèi)在抗氧化劑雙重作用保護神經(jīng)細胞對抗氧化應激。Jia等［5］在SHSY5Y細胞上的研究同樣得到硫辛酸能通過上調(diào)GSH等內(nèi)源性抗氧化分子保護細胞。

細胞老化的基本特征之一是細胞內(nèi)過氧化反應產(chǎn)物的積聚增多，公認的老化指標——脂褐素的形成與脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)物在細胞內(nèi)的積聚密切相關。神經(jīng)細胞老化涉及到與ROS相關的氧化應激［6］。氧化損傷是老化和與老化相關的許多神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的重要因素［7－8］。因此抗氧化越來越成為抗老化、保護神經(jīng)細胞和預防及治療與老化相關的神經(jīng)退行性疾病的重要策略和措施，相關藥物在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中應用越來越廣泛［9］。

硫辛酸作為外源性抗氧化劑，對細胞抗氧化能力的提升以及對細胞的保護作用除了與直接清除ROS、自身抗氧化功效有關外，對內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的誘導也值得關注。

（致謝：感謝上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司對本工作的大力支持和幫助）

［1］蔡琰，沈金坤，陸榮華 ．神經(jīng)細胞老化實驗研究模型：無血清條件下培養(yǎng)小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞［J］．實驗生物學報，1985，18（6）：453－458．

［2］張毅，苗玲，蘇敏，等 ．硫辛酸在神經(jīng)細胞老化過程中的細胞保護作用研究［J］．中國老年學雜志，2009，29（13）：1 161－1 163．

［3］Trujillo M，Radi R．Peroxynitrite reaction with the reduced and the oxidized forms of lipoic acid：New insight into the reaction of peroxynitrite with thiols［J］．Arch Biochem Biophys，2002，397：91－98．

［4］Navari－Izzo F，Quartacci MF，Sgherri C．Lipoic acid：a unique antioxidant in the detoxification of activated oxygen species［J］．Plant Physiol Biochem，2002，40：463－470．

［5］Jia Z，Hallur S，Zhu H，et al．Potent upregulation of glutathione and NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1by alpha－lipoic acid in human neuroblastoma SH－SY5Ycells：protection against neurotoxicant－elicited cytotoxicity［J］．Neurochem Res，2008，33（5）：790－800．

［6］Barja G．Aging in vertebrates and the effect of caloric restriction：a mitochondrial free radical production－DNA damage mechanism［J］．Biol Rev Camb Philos Soc，2004，79（2）：235－251．

［7］Gustavo Barja．Free radicals and aging［J］．Trends in Neurosciences，2004，27：595－600．

［8］Trushina E，McMurray CT．Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases［J］．Neuroscience，2007，145（4）：1 233－1 248．

［9］宋妤 ．依達拉奉在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應用［J］．中國實用神經(jīng)疾病雜志，2008，11（12）：131－133．