孫 強，王麗艷，荊瑞勇，郭永霞，殷奎德

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶163319）

菘藍（IsatisindigoticaFort．）為十字花科菘藍屬二年生草本植物，以干燥根及葉入藥，分別稱為板藍根和大青葉，為常用中藥材［1］。目前報道的菘藍栽培品種主要有二倍體和四倍體兩種倍性，有研究報道四倍體較二倍體中靛藍、靛玉紅、總氨基酸的含量均有明顯提高［2］，四倍體菘藍根中游離氨基酸和水解氨基酸的含量均高于二倍體［3］；二倍體菘藍較同源四倍體具有中等偏高的遺傳差異性［4］；四倍體菘藍體內超氧化物歧化酶的活性比二倍體的高［5］。在水分脅迫方面有對菘藍生長發(fā)育和有效成分積累方面的研究［6］，有對菘藍幼苗生長和生理特性影響方面的研究［7］，但其主要針對的是二倍體。有關二倍體和四倍體對干旱耐受能力的比較研究目前還未見報道。

干旱是限制植物基因表達、生長發(fā)育和產量的重要生態(tài)環(huán)境因素，對植物的危害在所有非生物脅迫中占居首位［8－9］，因此，當前世界各國均對干旱下植物的生長狀況給予了極大的關注。本試驗以在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的甘露醇模擬干旱脅迫，研究不同干旱程度對不同倍性菘藍種子萌發(fā)、幼苗生長和植物體內丙二醛、脯氨酸含量的變化來比較不同倍性菘藍對干旱脅迫的耐受能力，通過對比其體內保護性酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性變化來揭示其內在機理，為深入了解不同倍性菘藍的生長與生境的關系及其抗旱機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試材料為二倍體和四倍體菘藍，購于毫州市春秋藥材種業(yè)有限責任公司。

1．2 干旱脅迫處理方法

采用在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的甘露醇模擬干旱脅迫［10］。MS培養(yǎng)基中附加30g／L蔗糖、8 g／L植物瓊脂，pH值為5．7，分別附加濃度為0，50，100，150，200，250，300，350，400mmol／L的甘露醇進行干旱脅迫處理，以不加甘露醇作為對照。

將二倍體和四倍體菘藍種子去除種皮后用75%的乙醇處理5min，再用0．1%的升汞處理10min，最后用無菌水沖洗4～5遍，然后接種于上述不同處理的培養(yǎng)基中，每瓶20粒，每5瓶計為一個處理，每個處理重復10次，每個處理接種總計為50瓶，置于溫度為（25±2）℃的組織培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)，前三天進行暗培養(yǎng)，然后于光強1 500～2 000lx，每日光照時數(shù)14h的光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)7d，每天統(tǒng)計發(fā)芽率。培養(yǎng)到第10d時進行相關指標測定。

1．3 測定項目

1．3．1 發(fā)芽率和發(fā)芽勢

種子發(fā)芽率＝種子正常發(fā)芽粒數(shù)／供試種子數(shù)×100%；

種子發(fā)芽勢＝種子第4d正常發(fā)芽粒數(shù)／供試種子粒數(shù)×100%。

1．3．2 根長、芽長、根重和芽重的測定 當種子接入培養(yǎng)基10d后，大部分已有真葉抽出，小心取出幼苗，用蒸餾水洗去殘留的培養(yǎng)基，用一個透明的硬塑料板將幼苗壓平展，與帶刻度的標準直尺同時拍照。每個處理分別取20株幼苗進行拍照，然后用Image J軟件進行分析［11］。拍完照片后，立刻將幼苗用解剖刀切成芽和根兩部分，分別測定鮮重［12］。

1．3．3 丙二醛和脯氨酸含量的測定 將種子接種到培養(yǎng)基中10d后，取出幼苗測定植株莖葉中的丙二醛和脯氨酸的含量：丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法［13］；脯氨酸含量的測定采用磺基水楊酸比色法［13］。

1．3．4 保護性酶SOD、POD、CAT活性測定 SOD采用氮藍四唑（NBT）法進行測定［13］；POD采用愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘內A470變化0．01為1個酶活性單位（U）［13］；CAT的活性測定采用紫外吸收法進行測定，以每分鐘內A240下降0．1的酶量為1個酶活單位（U）［14］。

1．4 統(tǒng)計分析

利用Excel和SPSS 13．0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2．1 不同干旱脅迫處理下不同倍性菘藍的發(fā)芽率和發(fā)芽勢

隨著甘露醇濃度的增加，二倍體和四倍體菘藍發(fā)芽率均呈下降趨勢，隨著發(fā)芽時間的增長差異逐漸減小（圖1）。當甘露醇濃度為0～200mmol／L時第1天種子發(fā)芽率隨著濃度的增加而降低，濃度大于200 mmol／L時，種子在第1天均不能發(fā)芽。從二倍體和四倍體的差異來看，二倍體菘藍在甘露醇濃度為0，50mmol／L時第7天的發(fā)芽率達90%以上，分別為98%和100%，當甘露醇濃度為100，150，200mmol／L時發(fā)芽其發(fā)芽率均達80%以上，分別為89%、86%和83%，而當甘露醇濃度大于250mmol／L時發(fā)芽率迅速下降為60%左右，當甘露醇濃度達到400 mmol／L時，發(fā)芽率降低到50%以下。四倍體菘藍在甘露醇濃度為0，50，100，150mmol／L時第7天的發(fā)芽率均達90%以上，分別為100%、99%、95%和92%，當甘露醇濃度為200，250mmol／L時發(fā)芽其發(fā)芽率均達80%以上，分別為89%和82%，而當甘露醇濃度大于300mmol／L時發(fā)芽率迅速下降為60%左右，當甘露醇濃度達到400mmol／L時，發(fā)芽率降低到50%以下。由此可分析得出當甘露醇濃度為100～250mmol／L時對兩種倍性菘藍的發(fā)芽率影響有差異，四倍體的發(fā)芽率要高于二倍體，對二倍體的影響要大于四倍體，而高于或低于此范圍時的影響是相同的。因此可以得出，相對低濃度的甘露醇（100～250mmol／L）脅迫下四倍體菘藍對干旱脅迫的耐受性要高于二倍體菘藍。

圖1 不同濃度甘露醇處理對菘藍發(fā)芽率的影響

根據(jù)統(tǒng)計得到的發(fā)芽率，計算得到不同倍性菘藍的發(fā)芽勢，結果如圖2所示。從總體趨勢來看，二倍體和四倍體菘藍的發(fā)芽勢隨著甘露醇濃度的增加均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。在甘露醇濃度為0～250 mmol／L（150mmol／L除外），四倍體的發(fā)芽勢均高于二倍體，尤其是甘露醇濃度為250mmol／L時，四倍體遠高于二倍體。而大于300mmol／L時，二倍體反而大于四倍體。

2．2 干旱脅迫處理下不同倍性菘藍的根長、芽長、根重、芽重

不同濃度甘露醇培養(yǎng)基培養(yǎng)10d后組培苗的根長、芽長、根重、芽重統(tǒng)計結果如圖3所示。由于當甘露醇濃度大于250mmol／L時，在種子接種10天后，僅有芽發(fā)出而未能形成植株，個別形成植株但生長不正常，因此未對此部分進行統(tǒng)計分析。

圖2 不同濃度甘露醇處理下菘藍的發(fā)芽勢

圖3 不同濃度甘露醇處理對菘藍根長、芽長、根重、芽重的影響

二倍體和四倍體菘藍根長和根重均隨著甘露醇濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。兩種倍性菘藍的根長和根重均為甘露醇50mmol／L時最高，二倍體根長與對照無顯著性差異，而根重與對照差異顯著，與其它各濃度之間均存在顯著性差異。而四倍體根長和根重與其它所有濃度均有顯著性差異，并且甘露醇濃度為50，100mmol／L時的根長均高于對照。

四倍體菘藍芽長和芽重隨著甘露醇濃度的增加而呈現(xiàn)先稍有增加后降低的趨勢，當甘露醇為50 mmol／L時芽長和芽重最高，但從方差分析可以看出與對照無顯著性差異，而二倍體菘藍隨著甘露醇濃度的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，從方差分析可以看出甘露醇50mmol／L時與對照無顯著性差異，與其它濃度之間存在顯著性差異。

二倍體對照的根長、芽長、根重、芽重均高于四倍體對照，而隨著甘露醇的加入四倍體的又均高于二倍體。這說明干旱脅迫對二倍體植株生長情況的影響較四倍體的大，四倍體較二倍體對干旱脅迫的耐受能力強。

2．3 不同干旱脅迫處理下不同倍性菘藍的丙二醛和脯氨酸含量

不同濃度甘露醇處理下不同倍性菘藍中丙二醛含量的測定結果如圖4所示。二倍體和四倍體菘藍隨著甘露醇濃度的增加，丙二醛含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。從方差分析可以看出，二倍體菘藍甘露醇濃度為50mmol／L時丙二醛含量與對照差異不顯著，與其它各濃度之間差異達顯著水平。四倍體菘藍甘露醇濃度為50，100mmol／L時與對照之間丙二醛含量差異均不顯著，說明二倍體甘露醇濃度為50mmol／L時，四倍體甘露醇濃度達100mmol／L時，膜系統(tǒng)基本沒有受到損傷，隨著甘露醇濃度的增加，膜系統(tǒng)受損程度加重。二倍體菘藍丙二醛含量各濃度均高于四倍體菘藍，甘露醇濃度為250mmol／L時丙二醛含量達最大值，此時二倍體丙二醛含量較對照增加了2．89倍，四倍體增加了2．37倍。說明隨著甘露醇濃度的增加四倍體菘藍的膜系統(tǒng)受損傷程度低于二倍體菘藍。這在一定程度上說明四倍體菘藍較二倍體菘藍對干旱脅迫的耐受能力強。

從圖中4可以看出，隨著甘露醇濃度的增加，二倍體和四倍體菘藍脯氨酸含量均呈逐漸增加的趨勢。從方差分析可以看出甘露醇濃度為50mmol／L時，脯氨酸含量與對照之間差異不顯著，與其它各甘露醇濃度之間脯氨酸含量差異均達到顯著性水平。四倍體各濃度下脯氨酸含量均較二倍體高，隨著甘露醇濃度的增加四倍體較二倍體增加明顯，二倍體最大值是對照的4．38倍，四倍體最大值是對照的5．23倍。這在一定程度上說明四倍體菘藍較二倍體菘藍對干旱脅迫的耐受能力更強。

圖4 不同濃度甘露醇處理對菘藍丙二醛和脯氨酸含量的影響

圖5 不同濃度甘露醇處理對菘藍SOD、POD、CAT活性的影響

2．4 不同干旱脅迫處理下不同倍性菘藍的保護性酶SOD、POD、CAT活性

不同濃度甘露醇處理下不同倍性菘藍中保護性酶活性的測定結果如圖5所示，隨著甘露醇濃度的增加，二倍體和四倍體菘藍中SOD、POD和CAT三種保護性酶均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中SOD和POD均在甘露醇濃度為100mmol／L時體內酶活性最大，并且二倍體和四倍體相同。而CAT的變化二倍體和四倍體稍有差異，二倍體表現(xiàn)為甘露醇濃度為100mmol／L時體內酶活性最大，而四倍體則是甘露醇濃度為50mmol／L時體內酶活性最大。當甘露醇濃度從0增加到250mmol／L時，四倍體的SOD、POD和CAT三種保護性酶活性均高于二倍體。這說明在干旱脅迫下四倍體菘藍對活性氧的清除能力要高于二倍體菘藍。這也部分解釋了四倍體菘藍較二倍體菘藍對干旱脅迫的耐受能力強。

3 結論與討論

種子萌發(fā)是植物體生活史中重要的階段，直接影響到植物體后期的生長發(fā)育和形態(tài)建成，從而會間接影響產量的形成，因此種子能夠迅速整齊的萌發(fā)，是獲得高產、穩(wěn)產的基礎［15］。水分是種子萌發(fā)的必要條件，本試驗中隨著甘露醇濃度即脅迫程度的增加，二倍體的發(fā)芽率在甘露醇濃度為50mmol／L時達到最高，之后隨著甘露醇濃度的增加，發(fā)芽率呈逐漸下降的趨勢。四倍體菘藍的發(fā)芽率、二倍體和四倍體菘藍的發(fā)芽勢均隨著甘露醇濃度的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，這一結果與部分研究者的結果一致：宋軍生等［16］利用PEG－6000模擬干旱來研究不同干旱脅迫對板藍根種子萌發(fā)的影響，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均隨著PEG－6000濃度的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。張聃等［17］采用聚乙二醇高滲溶液人工模擬水分脅迫來研究濕地松種子萌發(fā)時的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)這三者均隨著聚乙二醇濃度的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；朱慧等［18］研究發(fā)現(xiàn)PEG－6000脅迫處理五爪金龍種子萌發(fā)的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均隨著PEG－6000濃度的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；朱教君等［19］的研究表明，聚乙二醇脅迫處理沙地樟子松種子萌發(fā)時的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均隨著聚乙二醇濃度的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。本研究結果顯示，相對低濃度的甘露醇（100～250mmol／L）脅迫下，四倍體菘藍對干旱脅迫的耐受性要高于二倍體菘藍。

丙二醛是膜脂過氧化的最終產物，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標志之一，其含量可以表示膜脂過氧化作用的程度［20］，可間接反映植物組織抗氧化能力的大小，因而用于鑒定植物的抗旱性［21］。二倍體和四倍體菘藍隨著甘露醇濃度的增加，丙二醛含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，膜系統(tǒng)受損程度越發(fā)加重，四倍體菘藍丙二醛最大值較對照的增加量低于二倍體，這在一定程度上說明四倍體菘藍較二倍體菘藍對干旱的耐受能力強。

脯氨酸是植物體內蛋白質的重要組成部分，當植物受到外界環(huán)境脅迫時，植物體內游離脯氨酸積累含量增加，在植物的滲透調節(jié)中起重要作用。即使在含水量很低的細胞內，脯氨酸溶液仍能提供足夠的自由水以維持正常的生命活動。植物體內游離脯氨酸含量在—定程度上反映了植物體內的水分情況，因而可以作為植物缺水情況的參考性生理指標［22］。二倍體和四倍體菘藍隨著甘露醇濃度的增加，脯氨酸含量呈逐漸增加的趨勢。四倍體各濃度下脯氨酸含量均較二倍體高，隨著甘露醇濃度的增加四倍體較二倍體增加明顯，說明四倍體菘藍較二倍體菘藍能耐受更強的干旱脅迫。

干旱是一種重要的非生物脅迫因子，它能使植物細胞膜脂受到傷害，同時也干擾植物細胞中活性氧的產生與清除之間的平衡，從而導致植物細胞遭受氧化脅迫。在正常條件下，植物組織細胞中產生的活性氧與清除系統(tǒng)保持平衡，當外界環(huán)境脅迫長期作用于植物后，產生的活性氧超出了清除系統(tǒng)的清除能力時，就會引起組織內活性氧積累而產生氧化傷害［23］，植物體為保護自身免受氧化傷害而形成一套相應的抗氧化保護系統(tǒng)，如SOD、POD、CAT等［24］。本試驗中隨著甘露醇濃度的增加二倍體和四倍體菘藍中SOD、POD和CAT三種保護性酶均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。酶活性之所以降低是因為在一定干旱脅迫范圍內，通過增加酶活性來提高適應干旱脅迫的能力，但當脅迫超出其忍耐范圍，保護酶活性則會下降，這與范蘇魯?shù)龋?5］對大麗花的研究結果一致。當甘露醇濃度從0增加到250mmol／L時，四倍體的SOD、POD和CAT三種保護性酶活性均高于二倍體。這說明在干旱脅迫下四倍體菘藍對活性氧的清除能力要高于二倍體菘藍。

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