龍民慧，朱澤軼，王園園，武立昌，白喜龍，刁愛坡*，王嘉璽，鄒民吉，徐東剛*

(1．華南師范大學生命科學學院，廣東廣州510631;2．軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，北京100850;3．天津科技大學生物工程學院，天津300457)

高血壓是動脈粥樣硬化發(fā)生的主要風險因素之一，大多數(shù)與高血壓相關的心血管病是動脈粥樣硬化并發(fā)癥．因此，高血壓動脈粥樣硬化防治的研究是熱點問題．SRH系是軍事醫(yī)科院研制的一種重組多功能融合蛋白［1］，與現(xiàn)有的葡激酶相比，除了有溶栓作用、抗凝等特點．炎癥在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用．已有研究證實SRH能夠通過減弱炎癥從而干預動脈粥樣硬化的發(fā)展并且具備安全性高等特點［2-3］，是良好的抗動脈硬化藥物，但是對其是否抑制高血壓癥并發(fā)動脈粥樣硬化的作用及機制研究尚未開展．

SHR大鼠(Spontaneously hypertensive rat，SHR)能自發(fā)形成高血壓，血管易發(fā)生損傷，自發(fā)改變血液狀態(tài)和引起血管重構(gòu)，形成斑塊，最后導致血管狹窄和斑塊不穩(wěn)，血栓形成．該大鼠模型除了用于抗高血壓藥物研發(fā)，也經(jīng)常用于研究抗動脈粥樣硬化藥物的動物模型，研究表明在飲食中添加脂類物質(zhì)就能迅速提高SHR血脂水平，容易引起脂肪沉著，形成斑塊．目前，用SHR模型評價抗動脈粥樣硬化藥物研究集中在干預血管重構(gòu)、改變血液粘稠度和凝血指標變化以及炎癥指標變化上，有部分研究也開始觀察SHR的血脂變化和動脈粥樣斑塊關系．本文旨在通過高血壓大鼠動脈粥樣硬化模型，觀察葡激酶突變體SRH對自發(fā)性高血壓癥大鼠動脈粥樣硬化發(fā)展的保護作用，為探討其抗動脈粥樣硬化提供依據(jù)．

1 材料和方法

1．1 材料

重組SRH蛋白由軍事醫(yī)學科學院基因組工程研究室所提供;血液生化指標檢測所用儀器及相關試劑由北京中同藍博臨床檢驗所提供;卵清白蛋白干粉和牛血清白蛋白干粉購自Sigma公司;牛脫氧膽酸鈉、膽固醇干粉購自北京普博欣生物科技有限公司;蛋黃粉、豬大油和白糖由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供;丙基硫氧嘧啶購自北京紅惠生物制藥股份有限公司．

1．2 試驗方法

1．2．1 大鼠模型篩選和動脈粥樣硬化模型建立正常大鼠WKY(Wistar Kyoto)大鼠20只，購自北京維通利華，動物編號為:SCXK(京)2006-0009，入選標準為:①180～200 g;②9周齡雄性大鼠;③試驗前經(jīng)全面觀察無異常表現(xiàn)．在恒溫(20℃ ±2℃)恒濕(50% ±5%)條件下飼養(yǎng)，自由飲水，每天人工照明12 h，正常飼料喂養(yǎng)5周，作為正常對照．20只雄性SHR大鼠，購自北京維通利華，動物編號為:SCXK(京)2006-0009，入選標準同WKY大鼠入選標準，用于建立大鼠的動脈粥樣硬化模型．SHR大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，給予高脂飼料(20%豬大油、5%白糖、3%膽固醇、0．5%膽酸鈉、0．2%丙基硫氧嘧啶、1%的蛋氨酸、1%維生素D，2%蛋黃粉，68%的基礎飼料)喂養(yǎng)4周并在高脂飼料開始喂養(yǎng)時進行免疫刺激，通過尾靜脈注射牛血清白蛋白，濃度按照32 mg/kg體重，頻次為每周3次，共3周;在牛血清白蛋白刺激的過程中同時用卵清白蛋白進行腹腔免疫，2．5 mg/kg，每3日1次，共3次．高脂飼料喂養(yǎng)1周后給大鼠一次性灌注維生素D3(25萬U/kg)．在恒溫(20℃ ±2℃)恒濕(50% ±5%)條件下飼養(yǎng)，自由飲水，每天人工照明12 h，高脂飼料喂養(yǎng)4周．

1．2．2 試驗分組及給藥方法 飼養(yǎng)5周后，20只WKY大鼠體重為205～221 g，平均為 (209±6．18)g;20只SHR大鼠體重225～247 g，平均體重為 (236±6．94)g．2種大鼠分別隨機分為生理鹽水組和SRH組，每組10只，生理鹽水組大鼠注射0．4 mL生理鹽水;SRH組大鼠按0．5 mg/kg體重給藥．SRH經(jīng)生理鹽水稀釋后2 min內(nèi)完成尾靜脈注射，每2天1次，共10次．

1．2．3 觀察指標

(1)臨床表現(xiàn) 觀察實驗動物出血情況，觀察部位有牙齦、腳趾、嘴、眼、耳、鼻、肛門、陰莖等尤其是注射部位及皮膚粘膜、內(nèi)臟和顱內(nèi)等，并監(jiān)測活動、飲食和外觀等生命體征．

(2)生理生化指標檢測 在給藥前和最后1次給藥后24 h后，通過靜脈采血采取所有大鼠血液，血液與枸椽酸鈉(0．13 mol/L)按9∶1 抗凝，3 000 r/min離心10 min，分離血漿．并監(jiān)測心電、血壓生理指標．Beckman CXⅣ全自動生化分析儀分析生化指標，包括部分凝血酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FG)、纖溶酶原(PLG)、D二聚體(D-D)、總甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、C反應蛋白(CRP)，其操作按照相關的說明書進行．

1．3 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)均表達為均數(shù)±標準差．各組數(shù)據(jù)之間顯著性檢驗用多個樣本均數(shù)比較及兩兩比較的ANOVA方差分析檢驗．

2 結(jié)果與分析

2．1 SRH對大鼠血脂水平的影響

生理鹽水組大鼠和SRH組大鼠均無出血現(xiàn)象．注射SRH和生理鹽水大鼠活動、飲食正常．注射SRH與注射生理鹽水的WKY大鼠的TG、TC、LDL、HDL無顯著性差異(P＞0．05);但注射SRH與注射生理鹽水的 SHR大鼠有顯著性差異(P＜0．05)，SRH能降低高脂喂養(yǎng)SHR大鼠的血脂水平(表1)．

2．2 SRH對大鼠凝血系統(tǒng)的影響

注射SRH與注射生理鹽水的WKY大鼠的FG、APTT、TT、PT 無顯著性差異(P ＞0．05);但注射SRH與注射生理鹽水的SHR大鼠的FG、TT、PT有顯著性差異，SRH能夠降低高脂喂養(yǎng)大鼠的FG水平(P＜0．05)，延長高脂喂養(yǎng)大鼠的 TT、PT(P ＜0．05)，對 APTT無任何影響(表2)．

2．3 SRH對大鼠纖溶系統(tǒng)的影響

纖溶指標PIG、PAI、D-D在WKY大鼠及高血脂的SHR大鼠中，生理鹽水組和SRH組均無顯著性差異(P＞0．05)(表3)，表明SRH對纖溶系統(tǒng)無影響．

2．4 SRH對大鼠血清心肌酶譜變化的影響

注射SRH與注射生理鹽水的WKY大鼠的CK、CK-MB、ASL、LDH 無顯著性差異(P ＞ 0．05)(表4);但注射SRH與注射生理鹽水的SHR大鼠的CK-MB、ASL、LDH 有顯著性差異(P ＜ 0．05)，SRH能夠減弱SHR大鼠心血管系統(tǒng)損傷．

2．5 SRH對大鼠血壓和心率變化的影響

注射SRH與注射生理鹽水的WKY大鼠在處理前后的血壓和心率無顯著性差異(P＞0．05)(表5);注射生理鹽水的高血脂SHR大鼠在處理前后血壓和心率有顯著性差異(P＜0．05)，有明顯的升高趨勢，但注射SRH的高血脂SHR大鼠在處理前后血壓和心率沒有顯著差異(P＞0．05)，比較注射生理鹽水和SRH后的高血脂SHR大鼠的血壓和心率有顯著下降(P＜0．05)，表明SRH能有效降低高血脂SRH大鼠的血脂水平．

表1 SRH對大鼠血脂水平的影響Table 1 Effect of SRH on blood fat in rats

表2 SRH對大鼠凝血指標的影響Table 2 Effect of SRH on blood coagulation in SHR rats

表3 SRH對大鼠纖溶系統(tǒng)的影響Table 3 Effect of SRH on blood fibrinolysis in SHR rats

表4 SRH對大鼠血清損傷的影響Table 4 Effect of SRH on blood damage in SHR rat

表5 SRH對大鼠心率和血壓的影響Table 5 Effect of SRH on BP and BR in WKY rat

3 討論

SHR大鼠易發(fā)生高血壓癥，高血壓容易造成血栓或動脈斑塊形成［4］．本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)14周齡SHR大鼠5周，SHR大鼠血漿TC、LDL水平升高，而與注射生理鹽水的高血脂SHR大鼠相比，注射SRH的SHR大鼠血漿中的TG、TC、LHL的水平有明顯降低(P＜0．05)．本實驗發(fā)現(xiàn):SRH能夠明顯改善SHR血液的高凝狀態(tài)，高脂給藥組FG明顯低于高脂生理鹽水組，PT、TT能得到明顯延長(P＜0．05);而高脂給藥組與WKY給藥組相比各項指標均無明顯差異．本實驗的一個重要發(fā)現(xiàn):PIG、PAI和D-dimer未見明顯變化，說明SRH對纖溶系統(tǒng)的功能不會造成影響，提示SRH溶栓后不會引起持續(xù)的系統(tǒng)纖溶亢進狀態(tài)．

當血管堵塞時，心肌細胞容易缺血缺氧或壞死，多種心肌酶可進入血液循環(huán)，引起血清心肌酶學升高［5］．鑒于各種心肌酶在機體組織中分布的非特異性，本實驗采用多項酶的聯(lián)合檢測來提高檢測的敏感性和特異性．結(jié)果發(fā)現(xiàn):SRH處理的SHR大鼠組的AST、CK-MB、LDH水平明顯低于生理鹽水處理的SHR大鼠(P＜0．05);說明SRH能夠降低高脂飼料喂養(yǎng)的SHR心肌酶學水平，減少循環(huán)系統(tǒng)的損傷程度．

心肌自主節(jié)律功能通過血壓、心率的變化來體現(xiàn)［6］．本次實驗結(jié)果證實SRH能夠降低SHR血壓水平，降低SHR大鼠的心率(P＜0．05)．這可能由于SRH減少SHR體內(nèi)炎癥反應，降低血液粘稠度和血管病變程度，從而降低了血壓，減少心臟負擔，使心律接近正常水平．

對正常喂養(yǎng)的WKY大鼠注射SRH，其血脂水平和生理鹽水組相比無顯著變化，可見使用SRH對正常大鼠脂肪代謝無顯著影響．正常大鼠注射SRH后FG、PT、APTT、TT無顯著差異，表明SRH對正常大鼠的內(nèi)外源性凝血功能未造成顯著影響，因而是相對安全的．血漿中PIG、PAI和D-dimer是反映纖溶狀態(tài)的良好指標，系統(tǒng)纖溶亢進時顯著增加［7-8］．本研究各組動物使用SRH這種溶栓劑溶栓后PIG、PAI均未出現(xiàn)下降，且D-dimer均無顯著變化，提示SRH未引起持續(xù)的系統(tǒng)纖溶亢進狀態(tài)．正常大鼠在使用SRH后其血壓和心率也未受影響，說明SRH未改變心血管功能．

本研究證實在動物實驗期間SRH是相對安全的，它能夠改善高血壓大鼠的血液高凝狀態(tài)和高血壓狀態(tài)，降低血脂水平，并且高血壓狀態(tài)下心率過快得以緩解，以上的實驗結(jié)果為進一步臨床的研究提供了一定的依據(jù)．

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