陳臻　徐秉良等

摘 要： 【目的】為了明確蘋果樹腐爛病菌有性態(tài)在不同生境條件下的發(fā)生情況及生物學(xué)特性，【方法】以甘肅省6市11縣（區(qū)）不同生境條件下患病的蘋果樹病皮為試驗(yàn)材料，對(duì)蘋果樹腐爛病菌有性態(tài)的形態(tài)學(xué)、形成時(shí)間、侵染性和子囊孢子萌發(fā)條件進(jìn)行研究?！窘Y(jié)果】甘肅省蘋果樹腐爛病原菌有性態(tài)為Valsa ceratosperma （Tode et Fr） Maire，僅分布在甘肅東部氣候較濕潤(rùn)的天水、平?jīng)觥c陽3地，形成時(shí)間天水在8月中下旬，平?jīng)龊蛻c陽在9月中下旬。平?jīng)鼍曜幽覛ぢ癫刈钌?，達(dá)809.85 μm，與天水、慶陽菌株差異顯著。三地的有性態(tài)子囊孢子在最適條件下均可萌發(fā)，36 h內(nèi)不同光照條件下，各地子囊孢子的萌發(fā)率差異不顯著。子囊孢子在不同光照和不同營(yíng)養(yǎng)條件下都能萌發(fā)，以全黑暗條件下和PDA培養(yǎng)基上的萌發(fā)率最高?！窘Y(jié)論】蘋果樹腐爛病菌有性態(tài)分布在氣候較為濕潤(rùn)、年平均溫度較高的地區(qū)，有性態(tài)無侵染性，光照和營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)子囊孢子萌發(fā)有顯著影響。

關(guān)鍵詞： 蘋果樹腐爛病； 有性態(tài)； 生境； 發(fā)生； 生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0644-06

蘋果樹腐爛病是世界上危害蘋果最為嚴(yán)重的病害之一，該病可造成樹勢(shì)衰弱、蘋果品質(zhì)和產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時(shí)甚至可造成毀園[1]。甘肅省是全國(guó)蘋果生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)和第2大省，截止2011年底，全省蘋果掛果面積30.7萬hm2，產(chǎn)量220萬t，產(chǎn)值約60億元[2]。但近年來，蘋果樹腐爛病發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為制約全省蘋果產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的重要因素。據(jù)甘肅省植保植檢站調(diào)查，2011年全省發(fā)病面積達(dá)7.5萬hm2， 平均發(fā)病株率達(dá)40%左右，白銀、天水、平?jīng)?、慶陽、隴南等地老果園發(fā)病嚴(yán)重，樹勢(shì)衰弱的果園可達(dá)60%左右。如何更好地防治該病，環(huán)境條件和致病菌的研究是關(guān)鍵。關(guān)于蘋果樹腐爛病原菌的研究國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道，但主要針對(duì)其無性態(tài)[3-5]，而有性態(tài)由于在田間比較少見，相關(guān)研究報(bào)道較少。最早關(guān)于有性態(tài)報(bào)道的是在1909年，日本學(xué)者宮部和山田[6]將蘋果樹腐爛病菌定為Valsa mali Miyabe et Yamada，Nakata[7]1941年研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)北部蘋果樹腐爛病菌為 V. mali，Kobayashi[8]根據(jù)病原菌形態(tài)，主張將蘋果樹腐爛病菌學(xué)名V. mali改為V. ceratosperma （Tode et Fr） Maire，Hayova等[9]曾提及Valsa malicola Z. Urb在中國(guó)可能有分布，王旭麗等[10]研究證實(shí)黑龍江和陜西蘋果樹腐爛病菌有性態(tài)分別為Valsa ceratosperma （Tode et Fr） Maire和V. malicola Z. Urb。對(duì)不同生境條件下蘋果樹腐爛病發(fā)生情況，謝紅江等[11] 分析了蘋果腐爛病發(fā)生程度與樹齡、品種、立地條件、季節(jié)及氣候因子的關(guān)系。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于蘋果樹腐爛病菌有性態(tài)在不同生境條件下的發(fā)生及生物學(xué)特性方面研究尚未見系統(tǒng)報(bào)道。為此，本研究選取了甘肅省有代表性生態(tài)區(qū)域的蘋果生產(chǎn)區(qū)，對(duì)不同立地條件下蘋果樹腐爛病菌有性態(tài)的地域分布、發(fā)生、侵染性及生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為探索病害流行規(guī)律及下一步防治工作奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 有性態(tài)形態(tài)學(xué)觀察 取患病蘋果樹病皮，徒手切片，觀察子座、子囊殼、子囊、子囊孢子的形態(tài)。測(cè)量不同地區(qū)有性態(tài)子囊殼的寬度、瓶頸的長(zhǎng)度和埋藏深度。

1.2.2 有性態(tài)與無性態(tài)比例 取14個(gè)地區(qū)的患病蘋果樹病皮，每個(gè)地區(qū)采集的病皮中隨機(jī)抽取50個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)1 cm2，進(jìn)行徒手切片，每個(gè)樣點(diǎn)20片。統(tǒng)計(jì)各個(gè)地區(qū)有性態(tài)和無性態(tài)的片數(shù)，得出有性態(tài)與無性態(tài)片數(shù)的比例。

1.2.3 子囊孢子懸浮液的制備 參照方中達(dá)[12]制備孢子懸浮液方法，取患病蘋果樹病皮，剔除周圍的組織，放在載玻片上，用刀片剖開，放在離心管中加無菌水，離心，棄去底部沉淀，即得到孢子懸浮液，并用無菌水稀釋至每視野（10×40）20～30個(gè)孢子，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子濃度。

1.2.4 分生孢子純培養(yǎng)的制備 使用瓊膠平板稀釋純化法[12]，用無菌水將樹皮上溢出的分生孢子角洗下，稀釋到每視野有5個(gè)左右的孢子，將稀釋后的孢子懸浮液涂在PDA平板上，等長(zhǎng)出單一菌落后，用打孔器打取單一菌落轉(zhuǎn)接到新PDA平板上，在PDA上得到純培養(yǎng)。

1.2.5 有性態(tài)的侵染性研究 選取1～2年生健康的蘋果樹枝條，截成15 cm的小段，用自來水沖洗干凈，枝條頂端石蠟封頂，接種時(shí)用脫脂棉蘸取75%的酒精擦洗滅菌，然后用滅菌水沖洗3次、風(fēng)干，用直徑 5 mm鐵釘釘帽燙傷枝條表皮，分別用純培養(yǎng)的菌餅（5 mm）和子囊孢子懸浮液接在枝條的燙傷部位，以PDA空白菌餅作對(duì)照，每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，置于瓷盤中25 ℃保濕培養(yǎng)，第7天觀察發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率。

1.2.6 不同地區(qū)子囊孢子萌發(fā)力測(cè)定 同1.2.3的方法配制子囊孢子懸浮液，參照劉振宇等[13]方法進(jìn)行子囊孢子萌發(fā)力測(cè)定。在較薄的PDA平板上用直徑9 mm的滅菌打孔器打取小圓塊，置于滅菌的載玻片上，孢子懸浮液均勻涂在PDA 小塊上，19 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)6次，以五點(diǎn)取樣法定時(shí)鏡檢，每個(gè)PDA 小塊鏡檢100 個(gè)孢子左右。每隔12 h統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)及孢子總數(shù)， 計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.2.7 光照條件對(duì)不同地區(qū)子囊孢子萌發(fā)的影響 設(shè)置全光照、全黑暗、12 h光照與12 h黑暗交替 3個(gè)處理[13]，將孢子懸浮液涂于PDA 小塊上，試驗(yàn)方法同1.2.6，每隔12 h統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)及孢子總數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.2.8 營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)不同地區(qū)子囊孢子萌發(fā)的影響 將子囊孢子懸浮液分別涂于PDA 小塊和10% ABA 小塊上[14]，試驗(yàn)方法同1.2.6。每隔12 h統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)及孢子總數(shù)， 計(jì)算孢子萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 有性態(tài)病皮和病原形態(tài)特征

2.2 有性態(tài)形成的地區(qū)及與無性態(tài)的形成比例

2.2.1 有性態(tài)的分布 14個(gè)采集地中，天水市果樹研究所，天水市麥積區(qū)南山萬畝果園基地、甘谷縣五里鋪村，慶陽市鎮(zhèn)原縣楊寧村、寧縣鐵王村，平?jīng)鍪星f浪縣高川村、靜寧縣吳廟村7個(gè)采集地均有有性態(tài)存在。表明甘肅省蘋果樹腐爛病菌的有性態(tài)主要分布在東部的慶陽、平?jīng)龊吞焖?市。

2.3 有性態(tài)形成時(shí)間及侵染性

2.3.1 有性態(tài)形成時(shí)間 有性態(tài)在天水、平?jīng)龊蛻c陽三地均有分布，但形成時(shí)間不同，天水在8月中下旬、平?jīng)龊蛻c陽在9月中下旬。

2.4 不同地區(qū)產(chǎn)生的子囊孢子萌發(fā)條件研究

3 討 論

關(guān)于蘋果樹腐爛病菌有性態(tài)的分布，本研究證實(shí)其分布多在氣候較為濕潤(rùn)、年平均溫度較高的甘肅東部地區(qū)，而干旱少雨、年平均溫度較低的河西走廊未發(fā)現(xiàn)。關(guān)于有性態(tài)不同生境下的分布國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，僅有王旭麗等[10]報(bào)道在陜西富縣和黑龍江伊春發(fā)現(xiàn)，病原為V. ceratosperma和V. malicola，這兩個(gè)地區(qū)氣候特征與甘肅東部地區(qū)較為類似。本研究病原形態(tài)特征鑒定結(jié)果顯示，甘肅省蘋果樹腐爛病菌有性態(tài)的病原為V. ceratosperma，未發(fā)現(xiàn)V. malicola。目前，對(duì)蘋果樹腐爛病菌病原生物學(xué)特性研究仍以無性階段分生孢子為主[16-19]，對(duì)有性階段子囊孢子的研究較少，且主要集中在溫、濕度和培養(yǎng)條件方面[20]，光照條件的研究未見報(bào)道，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有性態(tài)地區(qū)的溫、濕度等氣候條件以及子囊孢子萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)條件與Togashi[21]的研究一致，另外，通過光照條件對(duì)子囊孢子萌發(fā)的研究，明確了光照條件對(duì)子囊孢子萌發(fā)的影響。在有性態(tài)的侵染研究方面，Won[22]用烙傷接種法將V. mali接種健康樹皮未見發(fā)病。本試驗(yàn)在進(jìn)行病原菌侵染性研究時(shí)與以上一致，證實(shí)了有性態(tài)不具有侵染性，但是它在整個(gè)蘋果樹腐爛病菌侵染過程中的作用還不清楚，尚待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中三地區(qū)子囊殼的埋藏深度不同，這可能與當(dāng)?shù)貧夂?、環(huán)境條件等有一定關(guān)系，但深層次的原因有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

蘋果樹腐爛病菌有性態(tài)分布在甘肅東部地區(qū)，出現(xiàn)時(shí)間在8月中下旬至9月中下旬，進(jìn)一步證實(shí)了有性態(tài)無侵染性，不同光照條件、營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)子囊孢子萌發(fā)有顯著影響。（本文圖版見插6）

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