王永江　李中安等

摘 要：【目的】預測鑒定甜橙miRNA及其作用機制和功能，為深入研究挖掘甜橙miRNA及其抗病相關miRNA的作用等提供翔實的基因信息?！痉椒ā坷酶咄繙y序技術、相關的生物信息學軟件和數(shù)據(jù)庫，構建甜橙小RNA文庫，然后以甜橙基因組為參考基因組，進行甜橙miRNA鑒定和靶基因預測；利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對靶基因進行功能分析?！窘Y(jié)果】成功構建了甜橙小RNA文庫：獲得12 617 944條小RNA序列分屬于3 065 625種小RNA序列，獲得序列中24 nt長的序列最多，占到序列的49.3%。鑒定出2 199 561條miRNA，其中已知miRNA638 722條，分屬52種miRNA家族，候選miRNA1 560 839條，分屬204種miRNA。已知的52種保守miRNA基因預測出927個靶基因位點，候選miRNA中有154種預測出1 777個靶基因位點。GO數(shù)據(jù)庫對靶基因分類顯示，甜橙miRNA調(diào)控的靶基因主要參與多細胞互作、轉(zhuǎn)錄本調(diào)控和細胞組成等生物學途經(jīng)和分子功能方面。KEGG數(shù)據(jù)庫中病原物與寄主互作亞庫分析結(jié)果顯示，靶基因主要與抗性蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和抗病酶等關聯(lián)?！窘Y(jié)論】預測鑒定出一批甜橙miRNA及其調(diào)控的靶基因，為進一步研究提供了參考信息。

關鍵詞： 甜橙； miRNA； 靶基因； 高通量測序

中圖分類號：S666.4 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0526-11

甜橙是柑橘中栽培最多的一類品種，其種植面積占到柑橘總量的60%以上，對其研究具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是一類大小約為22 nt的內(nèi)源小分子RNA，其主要由莖環(huán)結(jié)構的前體物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生，其在基因表達、基因組表觀遺傳修飾和抗病毒等方面起著重要的調(diào)控作用[1-5]。

隨著第二代測序技術的廣泛應用，大量利用新一代測序技術研究miRNA的試驗被報道[6-13]。在柑橘miRNA的研究中，前人[11-13]通過高通量測序技術參考柑橘EST序列對枳中的miRNA進行研究鑒定；Xu等[10]通過高通量測序技術研究野生柑橘品種和普通品種間胡蘿卜素合成相關的miRNA；Wu等[14]對茯苓甜橙體細胞胚胎發(fā)育期的特異miRNA進行研究，鑒定出與胚細胞發(fā)育調(diào)控緊密相關的10個miRNA；陳曉東[15]利用高通量測序技術對椪柑試管苗葉片中的miRNA進行鑒定，并對其進行分類注釋，鑒定出一批miRNA。前期由于甜橙全基因組還沒有被公布，研究者們以柑橘的ESTs序列為參考基因進行miRNA的預測鑒定[11-13]。2011年初甜橙 （Citrus sinensis）全基因組的首次公布為深入研究甜橙的基因功能提供了一個有力的平臺，但還未見利用甜橙全基因組為參考基因組，深入全面的挖掘甜橙（C. sinensis）實生苗miRNA的報道，因此以甜橙全基因組作為參考基因組采用Solexa高通量測序技術研究甜橙miRNA具有重要的意義。我們的目的是挖掘出甜橙miRNA并預測其靶標位點，為深入研究甜橙miRNA的功能和作用機制等提供具有針對性的參考信息。

1 材料和方法

1.1 植物材料

選取2 a生西蒙斯甜橙（Citrus sinensis）實生苗5株，采摘其頂端嫩葉等量混合后提取總RNA，目的使提取西蒙斯甜橙的葉片RNA具有一定的代表性。該材料由國家柑橘苗木脫毒中心提供。

1.2 試劑

Trizol試劑購自Invitrogen公司，水飽和酚、氯仿、異戊醇、溴化乙錠（EB）、DEPC、瓊脂糖等購自鼎國生物工程公司。核酸外切酶Ⅰ購自上海生工生物有限公司。

1.3 儀器

1.5 文庫構建及其數(shù)據(jù)分析

1.6 保守miRNA的鑒定

利用miRBase（18.0）和NCBI相關數(shù)據(jù)庫進行比對，找出保守的miRNA。保守miRNA的鑒定標準為：（1）測序序列與數(shù)據(jù)庫中的保守序列匹配堿基數(shù)不少于16個堿基。（2）全序列錯配堿基數(shù)不多于3個堿基。（3）空缺不超過2個堿基等。（4）存在莖環(huán)的前體二級結(jié)構。對鑒定出的保守miRNA進行首位堿基、序列位點堿基偏好性分析。

1.7 候選miRNA的預測鑒定

利用軟件Mireap預測甜橙候選miRNA （novel-miRNA）。Mireap軟件由華大基因公司開發(fā)，該軟件根據(jù)miRNA前體的標志性發(fā)夾結(jié)構、前體物的二級結(jié)構、剪切子（Dicer）酶切位點信息、能量值等條件預測鑒定候選miRNA，具體條件參照前人[8，16-17]已報道的條件。（1）miRNA前體能折疊為發(fā)夾型二級結(jié)構。（2）成熟miRNA的候選序列位于發(fā)夾結(jié)構的一條臂上，而對應的miRNA*位于另一條臂上。（3）成熟miRNA和miRNA*的非匹配堿基數(shù)不能超過6個，miRNA*區(qū)不能形成發(fā)夾環(huán)。（4）預測的miRNA前體二級結(jié)構的自由能小于-18 kcal·mol-1。（5）miRNA中（A+U）含量必須在30%～70%。

1.8 miRNA靶標基因預測

利用Mireap軟件對預測出的miRNA進行靶基因預測。參照Allen等[18]和Schwab等[19]方法。其標準為：（1）miRNA和靶靶標基因復合體間相鄰位點的堿基錯配數(shù)小于等于2個堿基。（2）miRNA和靶標基因間不得超過4個的錯配（G-U為0.5個錯配）。（3）miRNA和靶標基因復合體間，miRNA的5′端開始第2～12個位點錯配堿基位點不得相鄰。（4）miRNA和靶標基因復合體的第10～11個位點沒有錯配堿基。（5）在miRNA和靶標基因復合體間，miRNA5′端起第1～12個位點堿基錯配數(shù)小于等于2.5（G-U為0.5個錯配）。（6）miRNA和靶標基因復合體的最低自由能應大于等于miRNA與靶標基因最佳互補體時最低自由能的75%。

1.9 GO富集分析

1.10 KEGG通路分析

利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/kegg）進行靶基因調(diào)控代謝通路分析。對映射比對結(jié)果進行顯著性富集，尋找與整個參考基因相比較在候選靶基因中顯著性富集的通路，預測靶基因參與的調(diào)控代謝路徑，篩選出參與病害互作通路的靶基因及相關的miRNA，為進一步研究甜橙抗病基因提供針對性的基因信息。富集分析計算公式同公式（1）。

其中N為所有基因中具有通路注釋的基因數(shù)目；n為N中的候選靶基因的數(shù)目；M為所有基因中注釋為某特定通路的基因數(shù)目；m為注釋為該特定通路的候選靶基因數(shù)目。概率P≤0.01的通路認為顯著關聯(lián)，即靶基因參與代謝通路的調(diào)控。

1.11 miRNA的液相雜交驗證

選取部分小RNA進行熒光素探針標記，隨后進行液相Northern雜交，方法參照Wang等[20]已報道的方法，其主要步驟有：（1）小RNA的提取分離；（2）核酸變性；（3）雜交，在低于每個探針Tm值10 ℃的溫度下進行雜交2 h以上；（4）酶切，雜交后的反應溶液中添加核酸外切酶I進行酶切反應，37 ℃ 2 h，80 ℃ 10 min；陰性對照為探針直接進行酶切；（5）電泳分離，酶切產(chǎn)物進行PAGE膠電泳，紫外光下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 文庫構建及數(shù)據(jù)分析

2.2 保守miRNA鑒定分析

鑒定結(jié)果顯示，638 720條序列分屬927種堿基序列類型，該927種序列類型比對數(shù)據(jù)庫（miRBase18.0）中55個家族，其中數(shù)據(jù)庫中的4個miRNA*也在測序數(shù)據(jù)庫中鑒定到。

2.3 候選miRNA的鑒定分析

2.4 靶基因預測分析

保守miRNA的靶基因預測結(jié)果如表2所示，52種保守miRNA基因型預測到927個靶基因位點。其中，一個miRNA調(diào)控一個靶基因的miRNA有3個，一個miRNA調(diào)控2個或2個以上靶基因的miRNA有49個，如csi-miR156miRNA可調(diào)控63個靶基因位點。

miRNA豐富的靶基因信息為進一步靶基因功能預測分析奠定基礎，為篩選與病害互作相關的基因提供了豐富的基因信息。

2.5 GO和KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析

結(jié)果顯示甜橙中保守miRNAs的927個靶基因和候選miRNAs的1 777個靶基因在GO數(shù)據(jù)庫中與分子功能、生物學過程和細胞組成3個亞庫中都有關聯(lián)，但其中最多的涉及生物過程（biological process ontology）和分子功能（the molecular function ontology），而與細胞組分（cellular component ontology）關聯(lián)較少。與biological process亞庫映射顯著性關聯(lián)的有66項，關聯(lián)富集顯著的前三個項分別為multicellular organismal process，其P值為6.64e-26，有2 192個基因映射關聯(lián)； multicellular organismal development，其P值為7.34e-24，有1 924個基因映射關聯(lián)； Transcription，其P值為1.05e-21，有1 306個靶基因映射關聯(lián)。與molecular function顯著關聯(lián)的有12項，主要有核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄本因子的激活、氧化還原酶的激活、核酸結(jié)合等。在細胞組分的生物本論項中，有2項映射顯著關聯(lián)，分別為轉(zhuǎn)錄因子復合體（transcription factor complex）和核質(zhì)（nucleoplasm）。

miRNA功能主要為信號傳導，調(diào)控靶基因表達等。預測結(jié)果顯示miRNA的靶基因主要與生物過程中的多細胞互作等項顯著關聯(lián)，結(jié)果與miRNA已報道的參與信號傳導等功能相符。

KEGG數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，靶基因最顯著關聯(lián)項為病原物與寄主互作代謝通路，其P值為4.14e-26，KO號04626。miRNA的靶基因主要與抗性蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、受體酶等相關聯(lián)。保守miRNA中，有143個靶基因與該數(shù)據(jù)高度相關聯(lián)，這143個靶基因中主要受miR172、miR390、miR472、miR396c和miR482a等的miRNA調(diào)控。關聯(lián)靶基因最多的為RPS2抗病蛋白，有133個靶基因與其顯著相關，其次為RPM1抗病蛋白，有93個靶基因相關。在保守miRNA靶基因相關聯(lián)的RPM1中的48個靶基因中，有5個是miR396c的靶基因、23個miR472的靶基因、20個miR482的靶基因。與RPS2相關聯(lián)的39個靶基因中，有1個為miR396c的靶基因、11個miR472的靶基因、16個miR482a的靶基因、11個miR482b的靶基因（表3）。

2.6 miRNA 液相雜交

結(jié)果顯示，陰性對照沒有印跡，陽性對照和樣品的雜交探針的印跡清晰（圖版-H）。雜交結(jié)果進一步增強了甜橙miRNA預測結(jié)果的真實性和深度測序獲得的miRNA的準確性。

3 討 論

利用高通量測序技術檢測鑒定miRNA，是當今發(fā)現(xiàn)和研究植物小RNA的一條重要途徑。HiSeq2000測序儀由Illumina公司根據(jù)Solexa技術開發(fā)的第2代高通量測序儀器。該測序儀采用邊合成邊測序技術，減少因二級結(jié)構造成的一段區(qū)域的缺失；一次性可獲得數(shù)百萬小RNA序列，能夠快速全面地鑒定該物種在該狀態(tài)下的微小RNA并能發(fā)現(xiàn)新的微小RNA；另外所測得的小RNA幾乎涵蓋所有RNA，是目前研究小RNA主要測序儀器之一[21]。

本實驗在鑒定保守miRNA時，鑒定到了數(shù)據(jù)庫中4種miRNA*，由于miRNA*極易降解，在生物體內(nèi)存在量不及miRNA的百分之一，能鑒定出miRNA*說明該實驗構建的小RNA文庫信息量豐富完整。同時，鑒定的保守和候選miRNA的成熟序列具有一般miRNA的5′端首位堿基偏“U”對“G”有抗性，第2～4位堿基缺“U”等普遍特性。前體物預測中，本研究預測miRNA前體物在62～362 nt與前人預測植物miRNA的前體物大小范圍一致。以上這些結(jié)果進一步增強了結(jié)果的準確性和真實性，同時也說明甜橙miRNA的前體物具有豐富的多樣性。

本研究測序獲得的小RNA序列中，24 nt的小RNA為主，占到總數(shù)的49.03%，這與陳曉東等[15]利用深度測序技術研究椪柑miRNA時，所測得序列以24 nt的序列最多占總條數(shù)的48.66%研究結(jié)果一致。說明結(jié)果具有一定的代表性，同時也增強了該結(jié)果的準確性。另外，在多數(shù)植物中也存在同樣現(xiàn)象，如莧菜試管苗[39]、擬南芥種子[40]等也是24 nt的reads最多，然而，有少數(shù)被子植物中以21 nt小RNA作為主要形式，如西紅柿[6]、楊樹（Populus）[41]、小麥（Triticum aestivum）[42]等。植物中不同DCL酶作用產(chǎn)生不同的大小的小RNA，DCL4酶作用產(chǎn)生21 nt的小RNA而DCL3酶產(chǎn)生24 nt大小的小RNA[2，4-5]；由此可推測甜橙植株內(nèi)，小RNA的產(chǎn)生主要受DCL3酶作用。

對miRNA的靶基因KEGG的病原物與寄主通路分析顯示，miRNA調(diào)控的靶基因有大量與病原物與寄主互作通路相關聯(lián)，說明miRNA參與了病原物與寄主互作途徑，為進一步研究甜橙抗感機制和基因提供了參考；同時也為研究甜橙miRNA在甜橙與病害互作用中的作用提供了思路和基因信息。在關聯(lián)的靶基因與其對應調(diào)控的miRNA中，有些miRNA有多個靶基因，且多個miRNA的多個靶基因共同調(diào)控一個因子。如保守的miR472、miR390、miR396和候選的novel-m015等都具有多個靶基因，而這些靶基因同時調(diào)控一個蛋白或轉(zhuǎn)錄因子。同時，也存有一個miRNA的多個靶基因參與多個蛋白或酶的調(diào)控，如mi-R472和miR482的靶基因分別與RPM1、RPS2、RPS5等關聯(lián)。這些關系的復雜性，為研究miRNA在病害與寄主互作中的作用提供了思路，同時也增加了研究的復雜性。

miRNA作為一個非常重要而且在飛速發(fā)展的研究領域，小RNA的形成機制與作用機理還有很多謎團有待進一步的挖掘探索。實驗獲得甜橙實生苗miRNA為進一步研究甜橙特異環(huán)境下特異miRNA提供了參考信息。甜橙特異環(huán)境條件下miRNA表達及其作用、基因調(diào)控網(wǎng)絡分析結(jié)果的生物學驗證、關鍵miRNA的功能與作用途徑等還需進一步研究。

4 結(jié) 論

本實驗鑒定出一批miRNA，并預測篩選出一批調(diào)控的靶基因與植物與病原物互作中高度相關的miRNA。為甜橙抗病基因的挖掘以及病原物互作信號傳導等研究提供參考信息，為進一步的深入研究奠定了基礎。（本文圖版見插1）

參考文獻 References：

[1] HUNTZINGER E， IZAURRALDE E. Gene silencing by microRNAs： contributions of translational repression and mRNA decay[J]. Nature Reviews Genetics， 2011， 12 （2）： 99-110.

[2] WU L， ZHOU H Y， ZHANG Q Q， ZHANG J G， NI F R， LIU C， QI Y J. DNA methylation mediated by a microRNA pathway[J]. Molecular Cell， 2010， 38（3）： 465-475.

[3] KIDNER C A， MARTIESSEN R A. The developmental role of microRNA in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005， 8： 38 -44.

[4] MALLORY A C， VAUCHERET H. Functions of microRNAs and related small RNAs in plants[J]. Nature Genetics， 2006， 38： 31-36.

[5] JOVER-GIL S， CANDELA H， PONE M R. Plant microRNAs and development[J]. International Journal of Developmental Biology，2005， 49： 733-744.

[6] MOXON S， JING R C， SZITTYA G， SCHWACH F， PILCHER R L R， MOULTON V， DALMAY T. Deep sequencing of tomato short RNAs identifies microRNAs targeting genes involved in fruit ripening[J]. Genome Research， 2008， 18： 1602-1609.

[7] FAHLGREN N， HOWELL M D， KASSCHAU K D， CHAPMAN E J， SULLIVAN C M， CUMBIE J S， GIVAN S A， LAW T F， GRANT S R， DANGL J L， CARRINGTON J C. High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs： evidence for frequent birth and death of miRNA genes[J]. PloS One， 2007， 2 （2）： e219.

[8] FRIEDLANDER M R， CHEN W， ADAMIDI C， MAASKOLA J， EINSPANIER R， KNESPEL S， RAJEWSKY N. Discovering microRNAs from deep sequencing data using miRDeep[J]. Nature Biotechnology， 2008， 26 （4）： 407-415.

[9] LI X Y， WANG X， ZHANG S P， LIU D W， DUAN Y X， DONG W. Identification of soybean microRNAs involved in soybean Cyst nematode infection by deep sequencing[J]. PloS One，2012，7（6）： e39650.

[10] XU Q， LIU Y L， ZHU A D， WU X M， YE J L， YU K Q， GUO W W， DENG X X. Discovery and comparative profiling of microRNAs in a sweet orange red-flesh mutant and its wild type[J]. BMC Genomics， 2010， 11（1）： 246.

[11] SONG C N， WANG C， ZHANG C Q， KORIR N K， YU H P， MA Z Q， FANG J G. Deep sequencing discovery of novel and conserved microRNAs in trifoliate orange （Citrus trifoliata）[J]. BMC Genomics， 2010， 11： 431.

[12] ZHANG J Z， AI X Y， GUO W W， PENG S A， DENG X X， HU C G. Identification of miRNAs and their target genes using deep sequencing and degradome analysis in trifoliate orange [Poncirus trifoliata L. Raf[J]. Molecular Biotechnology， 2012， 51： 44-57.

[13] SUN L M， AI X Y， LI W Y， GUO W W， DENG X X， HU C G， ZHANG J Z. Identification and comparative profiling of miRNAs in an early flowering mutant of trifoliate orange and its wild type by genome-wide deep sequencing[J]. PloS One，2012， 7（8）： e43760.

[14] WU X M， LIU M Y， GE X X， XU Q， GUO W W. Stage and tissue-specific modulation of ten conserved miRNAs and their targets during somatic embryogenesis of Valencia sweet orange[J]. Planta， 2011， 233（3）： 495-505.

[15] CHEN Xiao-dong. Germplasm conservation and microRNA identification of in vitro plantlets in citrus trees[D]. Fuzhou： Fujian Agriculture and Forestry University， 2011.

陳曉東. 柑橘試管苗種質(zhì)保存及其 microRNA 鑒定[D].福州： 福建農(nóng)林大學， 2011.

[16] LI Y， ZHANG Z， LIU F， VONGSANGNAK W， JING Q， SHEN B R. Performance comparison and evaluation of software tools for microRNA deep-sequencing data analysis[J]. Nucleic Acids Research， 2012，40（10）： 4298-4305.

[17] SONG Chang-nian， JIA Qi-dong， WANG Chen， LI Fei， ZHANG Zhen， FANG Jing-gui. Computational identification and analysis of the putative microRNAs in 32 fruit crops[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2010， 37（6）： 869-879.

宋長年，賈啟東，王晨，李飛，章鎮(zhèn)，房經(jīng)貴. 32種果樹microRNA的生物信息學預測與分析[J]. 園藝學報， 2010， 37 （6）： 869-879.

[18] ALLEN E XIE Z X， GUSTAFSON A M， CARRINGTON J C. MicroRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants[J]. Cell， 2005， 121： 207-221.

[19] SCHWAB R， PALATNIK J F， RIESTER M， SCHOMMER C， SCHMID M， WEIGEL D. Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome[J]. Develompmental Cell， 2005， 8 （4）： 517-527.

[20] WANG X S， TONG Y A， WANG S H. Rapid and accurate detection of plant mirnas by liquid northern hybridization[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2010， 11（9）： 3138-3148.

[21] SUN Hai-xi， WANG Xiu-jie. The development and future perspectives of DNA sequencing technology[J]. e-Science， 2009， 6： 19-29.

孫海汐，王秀杰. DNA測序技術發(fā)展及其展望[J]. e-Science， 2009， 6： 19-29.

[22] CHINCHILLA D， BAUER Z， REGENASS M， BOLLER T， FELIX G. The Arabidopsis receptor kinase FLS2 binds flg22 and determines the specificity of flagellin perception[J]. The Plant Cell Online， 2006， 18（2）： 465-476.

[23] ZIPFEL C. Pattern-recognition receptors in plant innate immunity[J]. Current Opinion in Immunology， 2008， 20（1）： 10-16.

[24] ZIPFEL C， KUNZE G， CHINCHILLA D， CANIARD A， JONES J D G， BOLLER T， FELIX G. Perception of the bacterial PAMP EF-Tu by the receptor EFR restricts Agrobacterium-mediated transformation[J]. Cell， 2006， 125（4）： 749-760.

[25] SWIDERSKI M R， INNES R W. The Arabidopsis PBS1 resistance gene encodes a member of a novel protein kinase subfamily[J]. The Plant Journal， 2001， 26（1）：101-112.

[26] BENT A F， KUNKEL B N， DAHLBECK D， BROWN K L， SCHMIDT R， GIRAUDAT J， LEUNG J， STASKAWICZ B J. RPS2 of Arabidopsis thaliana： A leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes[J]. Science， 1994， 265（5180）： 1856-1860.

[27] WARREN R F， HENK A， MOWERY P， HOLUB E， INNES R W. A mutation within the leucine-rich repeat domain of the Arabidopsis disease resistance gene RPS5 partially suppresses multiple bacterial and downy mildew resistance genes[J]. The Plant Cell Online， 1998， 10（9）： 1439-1452.

[28] GRANT M R， GODIARD L， STRAUBE E， ASHFIELD T， LEWALD J， SATTLER A， INNES R W， DANGL J L. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance[J]. Science， 1995， 269： 843-846.

[29] SHIRASU K， LAHAYE T， TAN M W， ZHOU F， AZEVEDO C， SCHULZE-LEFERT P. A novel class of eukaryotic zinc-binding proteins is required for disease resistance signaling in barley and development in C. elegans[J]. Cell， 1999， 99（4）： 355-366.

[30] WANG W， VINOCUR B， SHOSEYOV O， ALTMAN A. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science， 2004， 9（5）： 244-252.

[31] WANG G F， WEI X N， FAN R C， ZHOU H B， WANG X P， YU C M， DONG L L， DONG Z Y， WANG X J， KANG Z S，LING H Q， SHEN Q H， WANG D W， ZHANG X Q. Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein 90 （Hsp90）： Functional involvement of cytosolic Hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance[J]. New Phytologist， 2011， 191： 418-431.

[32] CHICO J M， CHINI A， FONSECA S， SOLANO R. JAZ repressors set the rhythm in jasmonate signaling[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2008， 11： 486-494.

[33] ABE H， URAO T， ITO T， SEKI M， SHINOZAKI K， YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. Arabidopsis AtMYC2 （bHLH） and AtMYB2 （MYB） function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. The Plant Cell Online， 2003， 15（1）： 63-78.

[34] DOMBRECHT B， XUE G P， SPRAGUE S J， KIRKEGAARD J A， ROSS J J， REID J B， FITT G P， SEWELAM N， SCHENK P M， MANNERS J M. MYC2 differentially modulates diverse jasmonate-dependent functions in Arabidopsis[J]. The Plant Cell Online， 2007， 19（7）： 2225-2245.

[35] BIRKENBIHL R P， DIEZEL C， SOMSSICH I E. Arabidopsis WRKY33 is a key transcriptional regulator of hormonal and metabolic responses toward Botrytis cinerea infection[J]. Plant Physiology， 2012， 159（1）： 266-285.

[36] JIANG Y Q， DEYHOLOS M K. Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 and WRKY33 transcription factors in abiotic stresses[J]. Plant Molecular Biology， 2009， 69（1）： 91-105.

[37] YOSHIOKA H，NUMATA N，NAKAJIMA K， KATOU S， KAWAKITA K， ROWLAND O， JONES J D G， DOKE N. Nicotiana benthamiana gp91phox homologs NbrbohA and NbrbohB participate in H2O2 accumulation and resistance to Phytophthora infestans[J]. The Plant Cell Online， 2003， 15（3）： 706-718.

[38] KAPLAN B， SHERMAN T， FROMM H. Cyclic nucleotide-gated channels in plants[J]. FEBS letters， 2007， 581（12）： 2237-2246.

[39] LIU Sheng-cai， LIN Yu-ling， CHEN Xiao-dong， LAI Zhong-xiong. Novel and conserved miRNAs identification during in vitro flowering of Amaranthus by solexa sequencing[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2011， 32（7）： 1296-1303.

劉生財， 林玉玲， 陳曉東， 賴鐘雄. 利用Solexa 測序技術鑒定莧菜試管開花過程中的miRNAs[J]. 熱帶作物學報， 2011， 32（7）： 1296-1303.

[40] CHEN Dong-ju. Analysis of small RNA deep sequencing data during seed development in Arabidopsis thaliana[D]. Fuzhou： Fujian Agriculture and Forestry University， 2011.

陳冬菊.擬南芥種子發(fā)育過程小RNA深度測序數(shù)據(jù)的分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2011.

[41] ABDELALI B， PHILLIP K W， SCOTT D， CLAUDE W D， JOHN E C. Conservation and divergence of microRNAs in Populus[J]. BMC Genomics， 2007， 8： 481.

[42] WEI B，CAI T，ZHANG R Z，LI A L，HUO N X，LI S，GU Y Q，VOGEL J，JIA J Z，QI Y J，MAO L. Novel microRNAs uncovered by deep sequencing of small RNA transcriptomes in bread wheat （Triticum aestivum L.） and Brachypodium distachyon （L.） Beauv[J]. Functional Integrative Genomics， 2009， 9： 499-511.