宋尚偉　張恒濤等

摘 要： 【目的】開(kāi)發(fā)蘋(píng)果 EST-SSR 引物，評(píng)價(jià)蘋(píng)果種質(zhì)資源的多樣性與親緣關(guān)系?！痉椒ā坷?NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中蘋(píng)果 EST 的 SSR 位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了 35 對(duì) EST-SSR 引物，建立了蘋(píng)果 EST-SSR 體系，并利用篩選出的 16 對(duì)引物對(duì)蘋(píng)果品種資源的親緣關(guān)系進(jìn)行研究?！窘Y(jié)果】118 份基因組 DNA 共擴(kuò)增出等位基因位點(diǎn) 138 個(gè)，位點(diǎn)數(shù)的變化從 3 到 13 不等，平均每對(duì)引物檢測(cè)到 8.62 個(gè)位點(diǎn)，總的多態(tài)性比率為94.2%，各引物的多態(tài)性比例分布為 81.8%～100%，相似系數(shù)為 0.48～1.00。利用 UPGMA 法構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)狀圖，在相似性系數(shù) 0.65 處可將 118 個(gè)供試材料分為5大組：其中第1組又可分為2個(gè)亞組，包含了絕大部分供試材料；第2、3、4和5組包含的品種數(shù)目分別為 12 個(gè)、11 個(gè)、3 個(gè)和 2 個(gè)；第5組與其他組親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相似性系數(shù)僅為 0.48?！窘Y(jié)論】篩選出的 16 對(duì) EST-SSR 引物可用于評(píng)價(jià)蘋(píng)果種質(zhì)資源間的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞： 蘋(píng)果； EST-SSR 引物； 親緣關(guān)系； 聚類(lèi)分析； 相似性系數(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0509-07

蘋(píng)果屬（Malus Mill.）植物種類(lèi)繁多，分布廣泛，多具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。之前，分類(lèi)學(xué)家從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、孢粉學(xué)、同工酶等方面對(duì)蘋(píng)果的親緣演化關(guān)系進(jìn)行研究并取得一定進(jìn)展[1-3]。但傳統(tǒng)方法對(duì)于差異不明顯的形態(tài)有時(shí)難以識(shí)別，一些特征易受生態(tài)環(huán)境的影響，SSR 標(biāo)記多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性突出，在蘋(píng)果及近緣種質(zhì)鑒別與親緣關(guān)系研究中也已得到應(yīng)用[4-6]。但開(kāi)發(fā) SSR 標(biāo)記過(guò)程繁瑣，成本較高，是其應(yīng)用的主要限制因素[7]。EST-SSR 標(biāo)記具有開(kāi)發(fā)效率高、成本低的特點(diǎn)，是 SSR 標(biāo)記的重要來(lái)源[8]，因其來(lái)自基因編碼區(qū)，更易獲得基因表達(dá)的信息，目前已經(jīng)應(yīng)用在葡萄[9]、甘蔗[10]、小麥[11]、大麥[12]、大豆[13]、水稻[14]等物種的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)演化研究等領(lǐng)域。近年來(lái)，隨著蘋(píng)果屬 EST 庫(kù)數(shù)據(jù)資源不斷豐富，開(kāi)發(fā) EST-SSR 標(biāo)記已具備了基礎(chǔ)，姚利華等[15]用開(kāi)發(fā)出的12 對(duì) EST-SSR 引物對(duì) 20 個(gè)蘋(píng)果品種的多樣性進(jìn)行了檢測(cè)，Gasic 等[16]對(duì)蘋(píng)果EST-SSR 在其他薔薇科植物上的應(yīng)用進(jìn)行了研究。我們擬利用數(shù)據(jù)庫(kù)資源開(kāi)發(fā)新的 EST-SSR 標(biāo)記，對(duì) 118 份蘋(píng)果種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，以豐富該類(lèi)標(biāo)記資源，并對(duì)育種中品種資源的評(píng)估、篩選與利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 EST-SSR 序列的查找 利用 SSR 鑒定軟件與網(wǎng)站在線(xiàn)搜索工具，從 GDR（http：//www.bioinfo.WSU.edu/gdr/）中搜索蘋(píng)果屬含有 SSR 的 EST 序列，并進(jìn)行可利用性篩選，篩選序列長(zhǎng)度不小于100 bp且不大于 700 bp 以及單至六堿基重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)至少為 10，6，5，5，5 和 5 的標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.2.2 EST-SSR 引物對(duì)的設(shè)計(jì) 應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5.0 對(duì)符合條件的部分 EST-SSR 序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì) EST-SSR 引物的原則和參數(shù)為：避免二級(jí)結(jié)構(gòu)；引物長(zhǎng)度一般控制在 18～22 bp；GC 含量在 40%～60%；理論退火溫度 （Tm） 在 55～60 ℃ ，且上下游引物Tm 值相差不超過(guò) 5 ℃；產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在 100～350 bp，以更加有效地?cái)U(kuò)增目標(biāo) SSR。引物委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 基因組 DNA 提取及檢測(cè) 采用改良的 CTAB 法[17]提取蘋(píng)果葉片總 DNA。獲得的 DNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280 比值；用 0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 純度。將合格的基因組 DNA原液稀釋到 20 mg·L-1 于-20 ℃ 條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SSR-PCR 擴(kuò)增 PCR 擴(kuò)增在 PTC-200PCR 儀上進(jìn)行。通過(guò)優(yōu)化確定了穩(wěn)定的蘋(píng)果 EST-SSR 反應(yīng)體系，即在 25 μL 體系中，MgCl2 濃度為 2.0 mmol·L-1，dNTPs 濃度為 0.3 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶用量為 1.0 U，DNA 模板用量為 1.5 mg·L-1，引物濃度為0.4 μmol·L-1。擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性 45 s，52 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 從供試材料隨機(jī)選取部分品種基因組 DNA 樣品，用不同引物在上述反應(yīng)體系中將其擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳后以條帶的多態(tài)性和穩(wěn)定性為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。以選出的引物對(duì)各供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，參照 Bassam 等[18]的銀染檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

凝膠上相同遷移率的條帶假定來(lái)自同一等位基因，每個(gè)反應(yīng)獨(dú)立進(jìn)行2次，不統(tǒng)計(jì)不穩(wěn)定的條帶或弱帶。每對(duì) EST-SSR 引物檢測(cè) 1 個(gè)位點(diǎn)，電泳圖譜的每條多態(tài)性帶均為一個(gè)分子標(biāo)記，代表引物結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)等位基因。根據(jù)條帶的有無(wú)統(tǒng)計(jì)所有二元數(shù)據(jù)，有帶計(jì)為“1”，無(wú)帶計(jì)為“0”。所有引物對(duì)供試樣品的讀帶記錄結(jié)果形成 1-0 矩陣，相似性系數(shù)利用NTSYS-pc2.10e 軟件中的 Qualitative date 程序來(lái)計(jì)算，獲得相似系數(shù)矩陣；聚類(lèi)分析用SHAN 程序和 UPGMA 方法進(jìn)行，聚類(lèi)圖通過(guò) Tree plot 模塊生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR 序列搜索結(jié)果

2.2 多態(tài)性 EST-SSR 引物的篩選

2.3 EST-SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

2.4 相似性系數(shù)與聚類(lèi)分析

在相似性系數(shù)為 0.65 處可將供試材料分為5個(gè)組，其中第1個(gè)組又可分為2個(gè)亞組，包含了絕大部分供試材料；第2個(gè)組有 12個(gè)品種（‘遼伏、‘首紅、‘禹冠、‘4354、‘華帥、‘早翠綠、‘哈蒂、‘5號(hào)紅星、‘美 2991、‘青香蕉、‘F4-4、‘禮泉短富）；第3個(gè)組有 11 個(gè)品種（‘理想、‘長(zhǎng)富 2、‘哈麗、‘華紅、‘80NY、‘布瑞本、‘紅肉蘋(píng)果、‘1996-1-21、‘葵花、‘紅奧和‘國(guó)光）；第4個(gè)組僅有 3 個(gè)品種（‘皇家富士、‘紅王將和‘早富）；第5個(gè)組僅有 2 個(gè)品種（‘孟諾耶和‘艾達(dá)紅），相似性系數(shù)為 0.48，與其他品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討 論

與其他分子標(biāo)記相比，EST-SSR 標(biāo)記來(lái)自表達(dá)基因的全部或部分序列，其多態(tài)性可能直接與該基因功能相聯(lián)系。 研究發(fā)現(xiàn)，水稻的蠟質(zhì)基因 5 端非編碼區(qū)中的 SSR 序列（CT）n 長(zhǎng)度變化不僅與直鏈淀粉的含量有關(guān)[18]。而且還決定了糯稻淀粉的理化特性[19]。因此根據(jù) EST 包含的 SSR 位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記，是直接與功能相關(guān)的功能標(biāo)記[20]。EST-SSR 標(biāo)記的這一特點(diǎn)決定了其在功能基因標(biāo)記方面應(yīng)用前景廣闊。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)蘋(píng)果 EST-SSR 引物的開(kāi)發(fā)，篩選出 16 對(duì)多態(tài)性好，對(duì)蘋(píng)果品種的區(qū)分能力強(qiáng)的引物。運(yùn)用 NTSYS-pc2.0e 軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，118 份蘋(píng)果品種的相似系數(shù)為 0.48～1.00，說(shuō)明供試的 118 份蘋(píng)果種質(zhì)資源間有較大的遺傳變異，遺傳多樣性較高。并根據(jù) 16 對(duì) EST-SSR 引物的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì) 118 個(gè)蘋(píng)果品種進(jìn)行了聚類(lèi)分析，可以看出 ，同一個(gè)親本蘋(píng)果基本上都聚在一起，盡管所檢測(cè)的 SSR 位點(diǎn)較少，但結(jié)果表明，絕大部分系譜相同或相近的品種聚在一起，個(gè)別品種分布在其他組中，與 Hokanson 等[21]的研究結(jié)果相近。說(shuō)明用 EST-SSR 標(biāo)記對(duì)蘋(píng)果種質(zhì)資源進(jìn)行分類(lèi)是可行的。

根據(jù)本試驗(yàn)聚類(lèi)分析的結(jié)果，第2個(gè)組有 12 個(gè)品種（‘遼伏、‘首紅、‘禹冠、‘4354、‘華帥、‘早翠綠、‘哈蒂、‘5 號(hào)紅星、‘美2991、‘青香蕉、‘F4-4、‘禮泉短富）；在這些品種中，‘首紅、‘哈蒂、‘5 號(hào)紅星均為元帥系的芽變，因此在生物學(xué)特性上有很多相似之處。而‘華帥的雜交親本為‘富士和‘新紅星，‘華帥的果實(shí)外觀與‘元帥幾乎沒(méi)有差別?！绱渚G與它們相比，同樣具有樹(shù)勢(shì)強(qiáng)健、樹(shù)冠緊湊、適合密植，果實(shí)圓錐或圓形，以短果枝結(jié)果為主，腋花芽形成能力強(qiáng)等特點(diǎn)[22-26]。第3個(gè)組 11 個(gè)品種中，‘長(zhǎng)富 2 為‘富士的芽變品種，而‘富士為‘國(guó)光與‘元帥雜交的后代?！畤?guó)光、‘富士、‘長(zhǎng)富 2、‘哈麗、‘葵花、‘布瑞本、‘紅奧這幾個(gè)品種都有樹(shù)勢(shì)強(qiáng)、果面底色淡黃色或黃綠色，果點(diǎn)小，果肉黃白色，肉質(zhì)細(xì)脆，汁多，酸甜適中等特點(diǎn)[22-25]。第4個(gè)組僅有 3 個(gè)品種，這3個(gè)品種均為富士系，‘皇家富士、‘早富為富士的不同芽變品種，其中‘紅王將為從高接的‘早生富士上發(fā)現(xiàn)的著色系芽變，風(fēng)味、采收期、樹(shù)勢(shì)與‘早生富士相近或相同[22]。上述結(jié)果表明，基于 EST-SSR 標(biāo)記的聚類(lèi)分析結(jié)果與品種間的系譜關(guān)系和表型是吻合的，因而應(yīng)用該技術(shù)對(duì)蘋(píng)果品種進(jìn)行遺傳關(guān)系研究，能夠?yàn)榉N質(zhì)的評(píng)估、利用和改良提供依據(jù)。

部分品種 EST-SSR 標(biāo)記聚類(lèi)分析結(jié)果與系譜資料不盡一致，如未將富士系芽變品種聚類(lèi)在一組；第5個(gè)組僅有 2 個(gè)品種，均為‘紅玉的雜種后代，親緣關(guān)系相近，但2者與其他品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相似性系數(shù)為 0.48。出現(xiàn)上述結(jié)果可能的原因之一，至少一部分 SSR位點(diǎn)與重要的育種性狀連鎖不緊密，所受的選擇壓力小，造成相同或相似系譜分離后代中不同等位基因在分配上的隨機(jī)性；其二，即使選自同一組合的品種，由于選育過(guò)程中選擇標(biāo)準(zhǔn)不同，仍可能造成較大的遺傳差異，而這種差異無(wú)法反映在系譜資料中；第三，蘋(píng)果基因組龐大而結(jié)構(gòu)復(fù)雜，少量的 SSR 標(biāo)記難以反映全部基因組所有區(qū)域上的遺傳差異情況。

4 結(jié) 論

利用蘋(píng)果 EST 數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)了 16 對(duì)多態(tài)性豐富的 EST-SSR 引物，并用其對(duì) 118 份蘋(píng)果品種資源的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，共擴(kuò)增出結(jié)合位點(diǎn) 138 個(gè)，總的多態(tài)性比率為 94.2%，供試材料相似系數(shù)的變化在 0.48～1.0，在相似性系數(shù) 0.65 處可將 118 份材料分為5組。研究表明篩選出的 16 對(duì) EST-SSR 引物可用于評(píng)價(jià)蘋(píng)果種質(zhì)資源間的遺傳多樣性。

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