李 輝，應詩家，施振旦

(江蘇省農業(yè)科學院畜牧研究所，江蘇 南京 210014)

髓樣細胞觸發(fā)受體1(Triggering receptor expressed on myeloid cells 1，TREM-1)是2000年發(fā)現的一種新型免疫球蛋白超家族成員，分子量約為30000，主要分布在外周血中性粒細胞、單核細胞亞群等天然免疫反應的效應細胞和肺泡吞噬細胞等細胞表面［1］。研究表明，TREM-1受體在炎癥反應中起著重要作用［2-3］，適度表達有助于加速機體對病原體的清除，過度表達則使TREM-1與其下游細胞因子形成正反饋自分泌調節(jié)回路，促使炎癥反應增強放大，導致過度的炎癥反應［4-7］，最終引起機體細胞損傷和多臟器功能衰竭，嚴重時將危及動物的生命。因此TREM-1被認為是整個炎癥反應中的關鍵觸發(fā)節(jié)點［8］。而通過降低TREM-1基因的表達或阻斷其信號傳導通路，可有效改變炎癥發(fā)生的規(guī)律，抑制炎癥過度反應的發(fā)生，提高被感染動物的生存率［9-10］。

TREM-1基因自發(fā)現后，多集中于人和小鼠炎癥相關領域的研究上，在家畜上的研究較少，目前只在牛［11］、水牛［12］和豬［13］上有報道。對于豬的TREM-1基因，GenBank僅收錄了3條 mRNA(CDS)序列(登錄號分別為:AY382477、AY382476和NM213756)，而沒有包含啟動子在內的全基因序列的資料。重要信息的缺乏，造成人們對其結構(例如:外顯子和內含子的數目、長度以及啟動子序列的長度、重要順式作用元件的數量和堿基構成等)了解較少，也因此阻礙了對該基因的進一步研究?；谏鲜鰡栴}，本試驗擬利用Genome walking技術克隆豬TREM-1基因包括啟動子在內的全部DNA序列，并對該基因的結構和啟動子序列進行詳細生物信息學分析，旨在為豬TREM-1基因功能的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

DNA genome walking kit、LA-Taq高保真DNA聚合酶、pMD18-T克隆載體購自大連TaKaRa公司，DH5α感受態(tài)細胞購自南京鼎國生物技術有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，豬基因組DNA由本實驗室凍存。試驗所用引物由Invitrogen公司合成，其他均為常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 豬TREM-1基因全序列的Genome walking PCR 根據GenBank收錄的豬TREM-1基因mRNA序列(登錄號:NM213756)，在3'端下游設計3條特異性引物，分別命名為SP1、SP2和SP3。根據DNA genome walking kit中所提供的隨機引物(AP)，以豬基因組DNA為模板，依次用引物SP1、SP2和SP3，按照試劑盒說明書推薦的反應程序進行3次交錯式熱不對稱PCR反應(特異性引物的設計原則及詳細的PCR操作過程按DNA genome walking kit說明書進行)。最后將3次PCR產物同時進行瓊脂糖凝膠電泳分析。如果Genome walking PCR成功，以SP3為引物的PCR會有特異擴增產物。電泳檢測時，所對應的泳道在紫外燈下可觀察到特異條帶。將特異條帶切膠純化回收后接入pMD18-T克隆載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆送生物公司進行測序，然后對獲得的DNA序列進行比對分析。確定序列正確后，以測序獲得的DNA序列為模板，在其5'端上游重新設計3條特異性引物，進行下一輪的熱不對稱PCR反應，向未知序列區(qū)延伸，操作過程同上。直至最終獲得豬TREM-1基因及其啟動子的全序列。

1.2.2 豬TREM-1基因的拼接比對及啟動子區(qū)序列的分析所獲得的全部DNA序列測序正確后，利用DNAStar、Bioedit7.0等軟件進行拼接。拼接后的DNA序列與GenBank收錄的登錄號為NM213756的序列利用Aligen(bl2seq)進行雙序列比對分析，獲得外顯子和內含子的數量、界限和長度。利用在線啟動子分析軟件Alibaba2.1(www.gene-regulation.com/pub/programs/html#alibaba2.1)，對獲得的豬TREM-1基因啟動子區(qū)序列進行預測，分析啟動子內調控其轉錄的重要順式作用元件的位置、數量及堿基構成。

2 結果

2.1 豬TREM-1基因序列的拼接和比對

經過多輪熱不對稱PCR反應，回收特異性條帶并測序后，將所得DNA序列拼接，獲得了包括啟動子序列在內的豬TREM-1基因共32414 bp。將拼接序列與GenBank中收錄的mRNA序列(NM213756)進行Aligen比對分析。結果發(fā)現，其啟動子區(qū)長度為10863 bp(1～10863)，結構基因長度為 21551 bp(10864～32314)，轉錄起始位點為第10864堿基。并且發(fā)現該基因由4個外顯子和3個內含子組成。其中第一外顯子長度為108 bp(10864～10971)，主要為編碼信號肽的序列，翻譯起始密碼子(ATG)位于第10923堿基處。第一內含子長度為12550 bp(10972～23521)，第二外顯子長度為357 bp(23522～23878)，第二內含子長度為1347 bp(23879～25125)，第三外顯子長度為204 bp(25126～25330)，第三內含子長度為 6713 bp(25331～32043)，第四外顯子長度為 371 bp(32044～32414)。終止密碼子和PloyA加尾信號序列分別位于第32044堿基和第32394堿基處。目前已將克隆所得的全基因序列提交至GenBank，分配的登錄號為KC688694。

2.2 豬TREM-1基因啟動子序列分析

通過在線啟動子分析軟件Alibaba2.1分析發(fā)現，在豬TREM-1基因啟動子序列中，與轉錄相關的重要順式作用元件大部分分布于轉錄起始位點上游5000 bp的范圍內。該區(qū)域中含有典型的TATA框(TATATATT)，位于轉錄起始位點上游-681 bp處。同時發(fā)現多個與維持啟動子基本轉錄活性相關的順式作用元件，如Sp-1(7個)、C/EBP(4個)以及NF-1(4個)等。而且上述各元件均坐落于鄰近TATA框的區(qū)域，位置的鄰近可能更方便轉錄復合物的組裝和轉錄的啟動。另外還發(fā)現應答LPS刺激和調控TREM-1基因表達的轉錄因子結合位點，例如:NF-κB(5個)、Ap-1(4個)以及PU-1(1個)等因子。3種轉錄因子結合位點集中于轉錄起始位點上游 -1600～-4500 bp的區(qū)域。

3 討論

本研究首次克隆并注釋了豬TREM-1基因的全基因組序列，對該基因的結構有了較深入的了解。并對啟動子區(qū)的重要轉錄因子結合位點進行了預測分析。在啟動子序列中找到了與調控TREM-1基因表達相關的NF-κB、Ap-1和PU-1等轉錄因子結合位點。在TREM-1基因表達中，NF-κB是其中最重要的轉錄因子，LPS與胞外受體結合后，經過一系列反應，最終引起抑制狀態(tài)的IκB的磷酸化，磷酸化后成為具有活性的NF-κB，并轉移至細胞核中，與TREM-1基因啟動子序列中的結合位點結合，促進 TREM-1基因的表達［14-17］。目前在小鼠TREM-1基因啟動子的研究中發(fā)現3個NF-κB結合位點。受到LPS刺激時，最末端的結合位點在提高TREM-1基因表達的過程中起主要作用［18］。同時還發(fā)現在LPS刺激時，AP-1可與c-cos/c-jun協(xié)同作用共同促進TREM-1的表達［18］，而PU-1則在負調控TREM-1基因表達方面有著不可替代的作用［19-21］。受到LPS刺激后，NF-κB和AP-1會迅速結合到TREM-1基因啟動子上，并啟動表達。但是PU-1的結合較慢(約15 min后才開始結合)［20］。在本研究中，雖然已通過分析獲得了重要轉錄因子的結合位點，但仍須進一步驗證。

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