張海松 閆巖

(1.江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校實(shí)訓(xùn)中心 江蘇徐州 221116; 2.徐州創(chuàng)源教育科技有限公司 江蘇徐州 221008)

1 概述

杜仲的組織培養(yǎng)是指在無菌條件下,將杜仲的莖尖、葉或種子培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上,給予適宜的培養(yǎng)條件,誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織,繼而誘導(dǎo)生芽、生根、最后長成完整的植株,達(dá)到杜仲迅速繁殖和規(guī)模繁殖,滿足需求。杜仲組織培養(yǎng)一般選用MS培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基pH5.8,蔗糖濃度0.3%,瓊脂0.8%,溫度25℃左右培養(yǎng)。

2 原理與流程

植物組織培養(yǎng)是把植物的器官、組織、細(xì)胞在無菌條件下培養(yǎng)在人工制備的培養(yǎng)基上,能夠繼續(xù)生長并分化發(fā)育成完整植株的過程。本實(shí)驗(yàn)是通過愈傷組織的誘導(dǎo),來完成杜仲的植株再生。

母液的配制→培養(yǎng)基的配制、滅菌和種子催芽以及外植體的選擇、消毒→初代培養(yǎng)(再生芽培養(yǎng))→觀察、記錄出芽率→繼代培養(yǎng)(增殖)→生根培養(yǎng)基的配制、滅菌(生根培養(yǎng))→再生芽接種→觀察、記錄生根率→確定杜仲生長最佳條件。

3 操作過程

3.1 來源及處理

杜仲種子選取當(dāng)年生成熟果實(shí)飽滿的種子。外植體選用杜仲種子發(fā)芽后所得到的無菌苗的芽、莖、葉、胚軸等。外植體一般切成0.5-1cm左右。在培養(yǎng)之前對其進(jìn)行消毒。

3.2 種子處理

取出種子,用自來水沖洗干凈,于30℃的溫水中浸泡1天,放在40℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天,浸泡3天后,將發(fā)脹種子外面的種皮撥掉,再把種子生根端剪破一個小口,以不損傷胚根為原則。先用75%乙醇消毒1min,用無菌水沖洗三次,再用次氯酸鈉溶液消毒20min,用無菌水再沖洗3～4次后,接在種子培養(yǎng)基(無激素)上。

3.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

以無菌獲得的杜仲的莖、莖尖或葉子為外植體,切成0.5-1cm左右,接種到愈傷培養(yǎng)的培養(yǎng)基里,莖和葉在培養(yǎng)基上幾周后開始形成愈傷組織。觀察不同的激素濃度對愈傷組織生長的影響。

3.4 初代培養(yǎng)

初代培養(yǎng)即為芽誘導(dǎo)。初代培養(yǎng)時主要用切割莖段法。本實(shí)驗(yàn)用杜仲種子培養(yǎng)長出的幼苗。當(dāng)幼苗長至5cm高時取其下胚軸,切成長0.8cm左右的小段,接種在不同種類和濃度的激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,幾周后從下胚軸兩端長出叢芽,將叢芽轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上,準(zhǔn)備進(jìn)行增殖培養(yǎng)。觀察并記錄不同種類和濃度的激素對芽誘導(dǎo)的影響。

3.5 繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁殖培養(yǎng)過程。目的在于繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗,最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件,營養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下,排除了其他生物的競爭,所以能夠按幾何級數(shù)增殖。

3.6 生根培養(yǎng)

當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后,就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程,這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。將已長大的芽轉(zhuǎn)入不同種類的生根培養(yǎng)基上或用一定濃度生長素浸泡處理后統(tǒng)計(jì)其生根狀況。

4 結(jié)果分析

4.1 種子發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)

經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì),去掉胚乳的種子發(fā)芽率為94.0%。

4.2 激素對愈傷組織的影響

4.2.1 NAA(生長素0.1g/L)濃度的影響

NAA為1.0mg/L時,誘導(dǎo)愈傷組織所需要的時間較2.0mg/L以下晚2～3天。NAA在2.0mg/L時,愈傷組織生長較好。NAA在2.5mg/L以下時,愈傷組織出愈時間、顏色、大小和繼代后生長差異較大。NAA在2.5～3.0mg/L時,愈傷組織顏色暗淡,沒有光澤,繼代后生長緩慢。NAA為3.0mg/L時,出愈時間比2.0mg/L晚2天,在僅有少量愈傷組織長出后,逐漸發(fā)褐,死亡。故NAA的最佳濃度為2.0mg/L。

4.2.2 6-BA(細(xì)胞分裂素0.1g/L)濃度的影響

在6-BA為0.1mg/L時,對愈傷組織誘導(dǎo)率影響不大,但有利于其生長。當(dāng)6-BA為0.3和0.5mg/L時,愈傷組織生長旺盛,呈奶油色,富有光澤,生活力強(qiáng);6-BA為1.0mgL時,愈傷組織的誘導(dǎo)和生長明顯受到抑制;BA為2.0mg/L時,愈傷組織有50%的出愈率,但長勢較差,繼代后很快枯死。故6-BA最佳濃度為0.5mg/L。

4.3 激素對芽誘導(dǎo)的影響

下胚軸在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天后,下胚軸的切口處隨著培養(yǎng)時間的增長逐漸分化出小叢芽,但在下胚軸的近芽端僅有愈傷組織產(chǎn)生而無芽的形成,三周后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。一般情況下細(xì)胞分裂素濃度高于生長素濃度時,有利于芽的形成。BA與NAA適當(dāng)濃度配合可提高出芽率。由下表可以看出,當(dāng)6-BA濃度在1.5～2.5mg/L之間,NAA濃度在0.5mg/L左右時,適宜于初代培養(yǎng)。且在0.5mg/L的NAA和2.0mg/L的6-BA時,最好。

4.4 激素對根的影響

以MS(1/2N)和蔗糖濃度2%為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的植物激素(NAA)進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后開始長出不定根,NAA最適合生根的濃度:1.0mg/L。

4.5 光照對芽生長的影響

不同的光照時間對芽的生長也有影響。研究證明,當(dāng)光照時間為每天12小時左右,光照強(qiáng)度為2500Lx時,生長最旺盛。

5 結(jié)語

在本次研究中,用植物組織培養(yǎng)的方法完成了杜仲種子發(fā)芽和杜仲愈傷組織的誘導(dǎo)、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)。研究了生長素奈乙酸(NAA)和細(xì)胞分裂素6-芐基嘌呤(6-BA)對杜仲愈傷組織誘導(dǎo)、初代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的影響,并確定了不同階段這兩種必要激素的最佳濃度。愈傷組織誘導(dǎo)最佳濃度為:NAA:2.0mg/L,6-BA:0.5mg/L;初代培養(yǎng)最佳濃度為:NAA:0.5mg/L,6-BA:2.0mg/L;生根培養(yǎng)最佳濃度為:NAA:1.0mg/L,最佳光照時間強(qiáng)度為:每天12小時左右,光照強(qiáng)度為2500Lx。

[1]朱致清主編.《植物細(xì)胞工程》.化學(xué)工業(yè)出版社出版.

[2]李浚明.植物組織培養(yǎng)教程.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社.