姚衛(wèi)紅 張麗娜 劉美秀

四川省雅安市食品藥品檢驗所，四川雅安 625000

1 菌種退化的主要表現(xiàn)

某一菌種如果在整體性能方面變得惡劣，并且這種變異并非由外界因素引起并遺傳給下一代，則成為菌種退化。菌種退化的具體表現(xiàn)一般有以下幾點：菌絲變得稀少，子實體原基的產(chǎn)量降低；菌種產(chǎn)生無性孢子的能力大幅度改變。菌種色香產(chǎn)生異變：色素量大幅度增加或減少，甚至由產(chǎn)出色素變?yōu)椴划a(chǎn)出色素，或者出現(xiàn)色素異?，F(xiàn)象。代謝產(chǎn)物的變化：菌絲變稀，菌球變少，毛刺少，易老化，空泡增加，培養(yǎng)周期變長。

2 菌種退化的原因

2.1 病毒感染

在菌株的長期使用中，菌絲體或者組織體感染了病毒，在菌種細(xì)胞與染色體內(nèi)同步復(fù)制，病毒顆粒因此形成一種感染潛伏，或稱平衡狀態(tài)。一旦變化的條件打破了這種平衡，則會引起菌絲生長速度減緩，菌絲細(xì)弱，氣生菌絲產(chǎn)量降低，不能夠徹底分解養(yǎng)料而出現(xiàn)木屑原色等現(xiàn)象。

2.2 營養(yǎng)不良

現(xiàn)在斜面試管PDA培養(yǎng)基是微生物的萬能培養(yǎng)基，其培養(yǎng)方法大同小異，多用木屑添加米糠或者麥麩等等。但是，如果長期使用基本相同的培養(yǎng)基，對于菌株來說往往滿足不了其營養(yǎng)上的生理要求，長此以往必定造成菌種的營養(yǎng)不良?；蛘咭驗榫N培育時間的不恰當(dāng)導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)養(yǎng)分耗盡，因此菌絲生長的活力大打折扣，導(dǎo)致菌種的退化。

2.3 無限傳代

母種生產(chǎn)中，分離出來的菌種直接應(yīng)用于生產(chǎn)，有的對擴大母種無限制地傳代、無限制地轉(zhuǎn)管，轉(zhuǎn)管越多，創(chuàng)傷越多，頻繁無性繁殖一般都是負(fù)變異占絕對優(yōu)勢[1]。這種無限傳代方面的變異積累到一定程度就會影響到菌絲的質(zhì)量和產(chǎn)量，并且能夠遺傳給后代菌種。

2.4 菌種保藏不當(dāng)

菌種的保藏是保證菌種質(zhì)量、減緩菌種退化的重要方法，因而菌種的保藏不當(dāng)很容易造成菌株的退化。目前保存菌種的方式很多，但都存在著導(dǎo)致菌種退化的潛在可能性。通?；蛐透淖冊谖⑸镏械耐蛔兟蕿?0-5-10-7。基因突變的幾率雖然很大，但是也有可能是因為菌種保藏不當(dāng)而造成的退化。

3 菌種的有效保藏

3.1 研究菌種退化與保藏的意義

隨著菌種保藏時間的延長或者菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代，菌種本身的細(xì)胞特質(zhì)有可能產(chǎn)生變化，或者延續(xù)優(yōu)良的基因性狀，或者產(chǎn)生變異，菌株的退化對于菌種的生產(chǎn)和發(fā)展十分不利，因此，研究菌種退化與保藏的意義就在于延續(xù)菌種的優(yōu)良性狀，保障菌種的質(zhì)量和產(chǎn)量，提高經(jīng)濟效益。

3.2 菌種保藏的目的和原理

菌種保藏的目的在于確保菌種的質(zhì)量，保證其不被污染，不產(chǎn)生變異，不死亡，以便達(dá)到使用、研究和交換等諸多方面的需求。菌種保藏的基本原則首先在于對菌種質(zhì)量的篩選，務(wù)必選擇質(zhì)量優(yōu)良的純種典型菌種進行保藏。其次，創(chuàng)造適合的保藏條件，以干燥、缺氧和低溫為原則，確保微生物長期處于生長繁殖受到抑制的休眠狀態(tài)，保證其不變質(zhì)的前提下令其保持代謝不活潑的情況。

3.3 菌種的有效保藏方法

3.3.1 低溫保存法 ①簡單保存。首先制作孢子培養(yǎng)物，將菌絲懸浮液提煉出來，并用大米、小麥、麥麩等谷物原料制成營養(yǎng)基，并以瓊脂斜面密封。將孢子培養(yǎng)物放置在4℃的冰箱內(nèi)保存，時間約為1～2個月。或者使谷物原料配置的孢子培養(yǎng)瓶處于真空狀態(tài)，并且在棉塞上浸蠟，以將外界的水汽和空氣隔絕出去，則保藏時間可以達(dá)到3～4個月。②超低溫保存。大多數(shù)微生物如多種細(xì)菌、放線菌、酵母和原蟲、病毒、噬菌體等都可以選取液氮超低溫保存的方式進行保藏，因為此類微生物不適用于簡單的冷凍干燥法。具體方法是將長期穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮液在10%的甘油或者其他低冰點液體中，在試管內(nèi)密封后迅速冷卻，將試管溫度下降至-35℃，然后保藏在-150～-196℃的液氮罐或其他超低溫環(huán)境中[3]。

3.3.2 脫水保存法 ①冷凍干燥法。冷凍干燥法可將孢子懸浮液與保護劑混合，一般可選取血清或脫脂牛奶進行混合，放置于-20～-30℃的乙醇液體中速凍。然后將安培管內(nèi)的空氣在低溫下抽干，并用干冰或五氧化二磷凍結(jié)水汽，將安培管熔封，低溫保存時間可達(dá)5～10年。②石蠟油封存法。石蠟封存法的保存期為一年以上，但是不能用于以石蠟油作為碳源的微生物，具體方法是將殺菌后的石蠟油倒在斜面菌種培養(yǎng)物上，高出斜面1厘米左右，放置在4℃冰箱內(nèi)或低溫干燥處保藏。③沙土保藏法。沙土保藏法適用于放線菌、霉菌以及能產(chǎn)生孢子的細(xì)菌，保藏時間可達(dá)到5～7年。將沙與土以3：2的比例混合，用稀硫酸洗凈過篩處理，裝入試管內(nèi)，高度為1 cm左右。進行2～3次滅菌，烘干，之后選取生長茁壯的孢子，用2～2.5 mL無菌蒸餾水制作成懸浮液，吸取適量孢子懸浮液滴入沙土試管，并進行真空抽干，使其外觀呈現(xiàn)松散狀態(tài)，放置于4℃冰箱內(nèi)保存。

[1] 李紅，肖千明，劉娜，等.食用菌菌種退化原因分析及復(fù)壯方法的探討[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：57-59.

[2] 夏鳳娜，胡惠萍，邵滿超，等.蛹蟲草菌種五種保藏條件的保藏效果對比試驗[J].食用菌，2010，32（5）：33-34.

[3] 宋越冬.蛹蟲草魯山株C0511菌絲液體培養(yǎng)條件[J].食用菌學(xué)報，2010，17（1）：52-54.