李雪慧 丁現(xiàn)帥

(陜西漢江藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，陜西 漢中 723000)

高效液相色譜法具有分離效能高、檢測靈敏度高、分析速度快、選擇性高等諸多優(yōu)勢，使其在分析領(lǐng)域中的到廣泛的應(yīng)用。反相色譜因其可分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物而成為高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。而反相色譜柱作為反相色譜分析的不可或缺的部分，它的日常維護(hù)、清洗與再生就顯得尤為重要。

在反相HPLC分析時(shí)，被分析樣品的基體往往會(huì)包含多種化合物，如鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)，這些可能在使用時(shí)與HPLC柱發(fā)生相互作用。一般情況下這些物質(zhì)有比分析者的目標(biāo)物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質(zhì)如鹽類一般來說在空體積時(shí)就被沖出色譜柱。這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負(fù)峰。如果樣品成分在柱子中有很強(qiáng)的滯留，多次進(jìn)樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會(huì)積累在柱頭。有著中等保留值的樣品可被慢慢洗脫，通常表現(xiàn)為寬峰，基線擾動(dòng)，或者基線漂移。

有時(shí)候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度時(shí)，就會(huì)覆蓋部分鍵合固定相表面，形成一種新的固定相。分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理，保留時(shí)間會(huì)發(fā)生漂移并產(chǎn)生拖尾峰。當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會(huì)有所不同。如果色譜柱被嚴(yán)重污染，柱子的反壓超過泵所能承受的最大壓力，而使分析工作無法進(jìn)行。被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復(fù)原來的操作條件。

再生被污染HPLC色譜柱的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣砣コ?。如果流?dòng)相pH值過大，則會(huì)破壞溶解硅膠而導(dǎo)致鍵合相流失，使得色譜柱無法恢復(fù)。

當(dāng)用二元混合溶劑進(jìn)行等度洗脫時(shí)，可用20個(gè)柱體積的90～100%的強(qiáng)洗脫溶劑沖洗清除污染物，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。如果使用的是緩沖液系統(tǒng)，應(yīng)該先用高純水沖洗5～10個(gè)柱體積后更換成強(qiáng)溶劑，以防HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，導(dǎo)致泵泄漏、管道堵塞及柱頭堵塞等。值得注意的是，在沖洗色譜柱時(shí)，應(yīng)將色譜柱從系統(tǒng)上取下，反向連接到輸液泵上，色譜柱出口不要連接到檢測器上，以免污染檢測器流動(dòng)池。

有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強(qiáng)的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來清洗柱子了，如果污染物是非生物物質(zhì)，可以跳過一個(gè)或多個(gè)另外的有機(jī)溶劑去除污染物。對于硅膠鍵合柱來說(如果沒有緩沖液的系統(tǒng))，一般清洗順序是：

用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相溶性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用水相溶劑，每種溶劑至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積，可以用1～2ml/min的流速來沖洗，要恢復(fù)原來的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。

四氫呋喃對很多物質(zhì)有很好的溶解性，因此是一種很好的清洗溶劑。如果柱子被嚴(yán)重污染，可以二甲基亞砜(DMSO)或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合，用低于0.5ml/min的流速?zèng)_洗色譜柱。

對于C18鍵合柱，為去除色譜柱中含有的緩沖鹽溶液或水溶性物質(zhì)時(shí)，應(yīng)使用含5%的有機(jī)溶劑的水溶液進(jìn)行沖洗。應(yīng)避免單獨(dú)使用水進(jìn)行沖洗，以免損傷色譜柱。

反相HPLC色譜柱的再生除用以上溶劑進(jìn)行清洗外，還可以根據(jù)具體情況用以下方法進(jìn)行再生：

(1)如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10%的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。

(2)如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。

總之，成功再生反相柱子是一個(gè)非常耗時(shí)間的過程，在進(jìn)行分析時(shí)，盡可能的做好樣品純化，并在分析工作結(jié)束后，及時(shí)清洗色譜柱，即使是長期不用的色譜柱也要進(jìn)行定期清洗維護(hù)，以免使色譜柱污染嚴(yán)重而無法使用。

［1］高效液相色譜方法及應(yīng)用，于世林，化學(xué)工業(yè)出版社，2004

［2］高效液相色譜儀的管理與維護(hù)，張燕婉，汪劭婷