周 潔，付 強(qiáng)，玉延華

（廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530004）

生物大分子之間或生物大分子與外源物質(zhì)之間的反應(yīng)熱極其微弱，需要用高度敏感的熱分析技術(shù)才能測(cè)定。目前常用的研究生物分子反應(yīng)的方法，如表面等離子共振技術(shù)（Surface plasmon resonance，SPR）［1］和超速離心分析技術(shù)［2］等，均要求蛋白質(zhì)固定于表面，這就會(huì)干擾蛋白質(zhì)間的結(jié)合，或耗費(fèi)很長時(shí)間。等溫滴定微量熱法（Isothermal titration calorimetry，ITC）是近年來發(fā)展起來的一種研究生物分子相互作用的重要方法［3］，其優(yōu)勢(shì)在于其非特異性、樣品用量小、方法靈敏度和精確度高、實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短、操作簡單等。ITC的非特異性有助于新現(xiàn)象和新規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，特別適用于研究生物體系中的各種特異過程；但也會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生由反應(yīng)環(huán)境造成的“背景”，干擾性大，難以獲得目標(biāo)反應(yīng)的理想檢測(cè)數(shù)據(jù)。要排除ITC的非特異性產(chǎn)生的不利影響，有必要對(duì)檢測(cè)樣品的預(yù)處理進(jìn)行優(yōu)化，創(chuàng)造一個(gè)“相對(duì)零背景”的反應(yīng)系統(tǒng)。

作者以人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）［4］與鋅離子的相互作用為研究對(duì)象，對(duì)ITC檢測(cè)樣品預(yù)處理進(jìn)行了優(yōu)化研究，以期獲得更高效、更理想的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 試劑與儀器

人血清白蛋白（HSA），Sigma公司；硫酸鋅（分析純），華大；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。將Tris－HCl（Solarbio，1×103mmol·L－1，pH＝7．4）配制成5mmol·L－1緩沖溶液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

iTC200型等溫滴定微量熱儀，GE；Lambda 35型紫外分光光度計(jì)，Perkin Elmer。

1．2 樣品預(yù)處理方法

A組：用5mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液配制0．05mmol·L－1HSA溶液200μL、2．5mmol·L－1硫酸鋅溶液40μL，直接用于反應(yīng)。

B組：（1）用5mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液配制0．2mmol·L－1HSA溶液2mL，用透析卡（Thermo，Slide－A－Lyzer○RDialysis Cassette，3500MWCO，0．5～3mL Capacity）進(jìn)行3次透析，透析緩沖溶液為5mmol·L－1Tris－HCl，每次使用體積600mL，透析條件為：第1次，4℃，2h，更換緩沖溶液；第2次，4℃，2h，更換緩沖溶液；第3次，4℃過夜，透析完成后的Tris－HCl緩沖溶液于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用專用注射器從透析卡中吸出HSA溶液，采用Bradford法測(cè)定HSA實(shí)際濃度。以第3次透析后存儲(chǔ)的Tris－HCl緩沖溶液為溶劑，將經(jīng)過3次透析的HSA溶液稀釋至濃度0．05mmol·L－1。（2）同法用此 Tris－HCl緩沖溶液配制濃度為2．5mmol·L－1的硫酸鋅溶液。（3）測(cè)定配制好的HSA溶液和硫酸鋅溶液的pH值，若兩者不一致，則調(diào)節(jié)pH值至相差不超過0．05。

1．3 ITC檢測(cè)方法

A組：在iTC 200軟件中的 Advance Experimental Design設(shè)置ITC實(shí)驗(yàn)參數(shù)：0．05mmol·L－1HSA溶液200μL，2．5mmol·L－1硫酸鋅40μL；反應(yīng)溫度25℃；總注射次數(shù)19次；參照功率5μcal·s－1；攪拌器轉(zhuǎn)速1000r·min－1。結(jié)果用 Origin（MicroCal，LLC ITC200）軟件進(jìn)行分析，得到結(jié)合常數(shù)（Kb）、反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量數(shù)（N）、熵（ΔS）和焓（ΔH）。

圖1 HAS－Zn2＋相互作用的ITC檢測(cè)結(jié)果Fig．1 The ITC determination results for HSA－Zn2＋interaction

B組：首先，利用iTC 200軟件的Experimental Design模塊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)。Experimental Mode選擇Highest Quality，在 Estimate Kd中的 Cell Compound選擇 Protein，Syringe Compound 選擇 Small Molecule，預(yù)估 ΔH 為1kcal·mol－1。鍵入不同的Cell、Syringe濃度值可得到不同實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)反應(yīng)曲線，根據(jù)預(yù)測(cè)曲線選擇適合的濃度值。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)后，選擇HSA 0．05mmol·L－1、硫酸鋅2．5mmol·L－1作為反應(yīng)濃度。然后根據(jù)預(yù)估結(jié)果，在Advance Experimental Design中設(shè)置ITC實(shí)驗(yàn)參數(shù)：0．05mmol·L－1HSA溶液200μL，2．5mmol·L－1硫酸鋅40μL；反應(yīng)溫度25℃；總注射次數(shù)19次；參照功率5μcal·s－1；攪拌器轉(zhuǎn)速1000r·min－1。結(jié) 果 用 Origin（MicroCal，LLC ITC200）軟件進(jìn)行分析，得到結(jié)合常數(shù)（Kb）、反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量數(shù)（N）、熵（ΔS）和焓（ΔH）。

2 結(jié)果與討論

2．1 ITC檢測(cè)結(jié)果

將HSA與硫酸鋅分別按A、B組方案進(jìn)行樣品預(yù)處理和ITC檢測(cè)，結(jié)果見圖1，獲得的結(jié)合參數(shù)見表1。

由圖1可知，A組HSA－Zn2＋相互作用過程中反應(yīng)峰值始終較大，表現(xiàn)出反應(yīng)一直沒有達(dá)到平衡狀態(tài)，難以從滴定曲線判斷結(jié)合類型，同時(shí)沒有獲得有效的數(shù)據(jù)（表1），無法對(duì)分子間相互作用力進(jìn)行推斷，因此認(rèn)為A組檢測(cè)結(jié)果不可用。

由圖1還可知，B組 HSA－Zn2＋相互作用的特征性的峰序列表現(xiàn)出良好的臺(tái)階，并最終顯示滴定接近平衡，反應(yīng)飽和，殘余的熱效應(yīng)符合稀釋峰的特征，可以通過Origin軟件的非線性回歸分析減掉。表1數(shù)據(jù)表明，B組 HSA－Zn2＋為放熱反應(yīng)［5］，只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，是一個(gè)焓驅(qū)動(dòng)的過程（ΔH＜0），同時(shí)根據(jù)公式ΔG＝ΔH－TΔS［6］，Gibbs結(jié)合能ΔG＜0主要由ΔH＜0貢獻(xiàn)，因而推斷，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度和比例下，HSA與Zn2＋之間主要的作用力為氫鍵和范德華力［7］。

表1 HSA－Zn2＋相互作用的結(jié)合參數(shù)Tab．1 The binding parameters for HSA－Zn2＋interaction

2．2 討論

在ITC檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，良好的反應(yīng)系統(tǒng)是得到理想結(jié)果的關(guān)鍵，但要實(shí)現(xiàn)“絕對(duì)零背景”很難，而創(chuàng)造“相對(duì)零背景”的系統(tǒng)則可以通過對(duì)樣品預(yù)處理的優(yōu)化來實(shí)現(xiàn)。經(jīng)過透析、濃度測(cè)定、pH值調(diào)節(jié)等一系列預(yù)處理的B組HSA－Zn2＋獲得了良好的ITC檢測(cè)結(jié)果。

（1）HSA粉劑中的甘油、防凍劑等輔分可能對(duì)另一反應(yīng)物產(chǎn)生作用或?qū)φ麄€(gè)反應(yīng)體系產(chǎn)生影響，從而產(chǎn)生額外的熱量，成為不屬于特異性反應(yīng)的背景熱。而其它通過提取及純化的蛋白樣品由于提取試劑的影響，同樣存在背景熱。本研究中蛋白經(jīng)過3次透析后，不僅被Tris－HCl緩沖溶液充分溶解且與緩沖溶液體系達(dá)到了很好的平衡。利用第3次透析的緩沖溶液作為另一反應(yīng)物的溶劑保證了兩種反應(yīng)物在體系上達(dá)到了更好的一致性，是實(shí)現(xiàn)“相對(duì)零背景”系統(tǒng)的關(guān)鍵。

（2）由于ITC檢測(cè)的是活性蛋白與小分子作用所產(chǎn)生的反應(yīng)熱，需要提供給分析軟件的數(shù)據(jù)只有兩個(gè)反應(yīng)物的濃度值，因此，透析后對(duì)蛋白濃度再次進(jìn)行定量以得到準(zhǔn)確的濃度非常必要。

（3）由于不能排除反應(yīng)物在被緩沖溶液溶解或稀釋后是否會(huì)發(fā)生pH值變化，相對(duì)于生物分子間相互作用的微量結(jié)合熱，酸堿中和熱無法忽略，會(huì)成為干擾，因此在ITC實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)格調(diào)控pH差值在0．05之內(nèi)很重要。

（4）透析可以選擇透析袋或透析卡，透析袋價(jià)格便宜，但使用前需要進(jìn)行預(yù)處理，導(dǎo)致透析步驟增加，影響樣品質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的因素增多。透析卡價(jià)格較貴，但人為影響小，便于進(jìn)行質(zhì)量控制，提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，對(duì)于重要樣品，建議使用透析卡等預(yù)制品。

3 結(jié)論

等溫滴定微量熱法（ITC）是近年來發(fā)展起來的一種研究生物分子相互作用的重要方法。在研究蛋白質(zhì)與外源小分子的相互作用時(shí)，優(yōu)化樣品的預(yù)處理，通過將蛋白質(zhì)進(jìn)行3次透析、準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)實(shí)際濃度、調(diào)控pH值和使用第3次透析緩沖溶液作為溶劑，實(shí)現(xiàn)了“相對(duì)零背景”的反應(yīng)系統(tǒng)。將未優(yōu)化組和優(yōu)化處理組樣品所進(jìn)行的ITC檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，表明進(jìn)行樣品預(yù)處理的優(yōu)化對(duì)獲得有效的檢測(cè)結(jié)果十分必要。

（致謝：感謝何容博士、任薇薇博士對(duì)本研究的理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。）

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