吳朝陽，羅飛飛，欒崇林，蔣曉華，梅瓊之

（1.湖南大學(xué) 化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室，湖南 長沙 410082；2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055）

苯醚菊酯是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的一種，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一類常用的殺蟲殺螨劑.許多學(xué)者通過對哺乳動物的慢性／亞慢性毒性試驗和長期接觸該藥的人群進行調(diào)查，研究表明擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，能干擾性激素水平，具有擬雌激素活性和雄性生殖毒性[1－4].因此，建立快速準確檢測擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的方法十分必要.傳統(tǒng)的檢測農(nóng)藥的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法以及各種光譜聯(lián)用技術(shù).這些方法大多儀器貴重、操作復(fù)雜、耗費時間長，給人們使用帶來不便.電化學(xué)傳感器具有簡單、快速、靈敏、選擇性高等優(yōu)點，近年來，采用電化學(xué)傳感器對環(huán)境污染物的檢測越來越受到學(xué)者們的關(guān)注[5－6].

分子印跡技術(shù)是指制備對某一特定分子（模板分子或印跡分子）具有高度選擇性和識別性的新技術(shù)[7－8].通過分子技術(shù)可獲得高度穩(wěn)定的聚合物，即分子印跡聚合物，它的識別位點是根據(jù)待測分子的結(jié)構(gòu)和官能團“量身定做”的，因此可以特異性識別待測分子[9－12].本文以苯醚菊酯為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，二者以氫鍵結(jié)合形成復(fù)合物，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，其將復(fù)合物以特定的空間構(gòu)型固定下來形成分子印跡聚合物，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑引發(fā)聚合，選用合適的洗脫溶劑將苯醚菊酯洗脫除去，留下的三維空穴可以特異性識別苯醚菊酯.本實驗結(jié)合電化學(xué)傳感器和分子印跡技術(shù)的優(yōu)點，使設(shè)計的傳感器具有快速、靈敏、低成本、選擇性好等優(yōu)點，檢出限為2.0×10－7mol／L.同時該傳感器具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可以多次重復(fù)使用.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI 900B電化學(xué)工作站 （上海辰華儀器有限公司）；三電極體系：洗脫掉模板分子的印跡電極為工作電極，飽和Hg2Cl2電極 （SCE）（上海越磁電子科技有限公司）為參比電極；鉑電極 （上海越磁電子科技有限公司）為輔助電極.

試劑：苯醚菊酯 （德國 Dr.Ehrenstorfer公司），甲基丙烯酸 （MAA），乙二醇二甲基丙烯酸脂（EGDMA），偶氮二異丁腈 （ABIN），氯仿，甲醇，乙腈，乙醇，正己烷，丙酮，乙酸等，以上試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑公司，均為分析純.

1.2 試劑除雜

甲基丙烯酸很容易聚合形成水溶性聚合物，用減壓蒸餾的方法進行提純，主要是除去其中的阻聚劑.偶氮二異丁腈也需提純，先將其溶于45℃的乙醇中至飽和，然后室溫下冷卻結(jié)晶，再抽濾，最后干燥除去大部分雜質(zhì).

1.3 電極的處理

依次用粒徑為0.3μm，0.05μm的 Al2O3粉末打磨處理金電極至光滑的鏡面，依次用超純水、乙醇、超純水各超聲3min，取出電極，吸水紙擦干，放入現(xiàn)配的piranha（VH2O2∶VH2SO4＝1∶3）溶液中浸泡清洗5min.

1.4 印跡電極和非印跡電極的制備及模板分子的洗脫

取模板分子苯醚菊酯0.01mmol（3.3μL）和功能單體 MAA 0.04mmol（3.4μL），將其加入100μL的乙腈中，室溫下放入搖床中震蕩4h混勻，加入交聯(lián)劑EGDMA 75.44μL （0.4mmol）繼續(xù)震蕩混勻，再加入0.8mg的引發(fā)劑ABIN，滴10 μL于金電極表面，然后放入60℃ 的恒溫槽中熱引發(fā)聚合12h，制備好印跡電極.非印跡電極的制備除不加模板分子外，其他步驟和印跡電極的制備步驟相同.將制備好的印跡電極于混合溶劑（V丙酮∶V乙酸＝5∶1）中浸泡9h，至模板分子基本洗出.

1.5 模板分子的識別

將洗脫后的印跡電極浸入不同濃度的苯醚菊酯溶液 （溶劑為正己烷）中5min，取出后于2mmol／L的 混 合 鐵 鹽 [由 K3Fe（CN）6和K4Fe（CN）6組成]中掃循環(huán)伏安曲線 （CV）和差分脈沖伏安曲線 （DPV），以恒電位下 Fe（CN）63－／4－的峰電流隨苯醚菊酯濃度的變化值作標(biāo)準曲線.最后用相同的方法對苯醚菊酯樣品進行檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 印跡電極的驗證

分別將印跡電極、洗脫后的印跡電極置于2 mmol／L的混合鐵鹽中進行循環(huán)伏安掃描，得到圖1中曲線1和曲線2.從圖中可看出：混合鐵鹽在印跡電極上的響應(yīng)電流很小 （曲線1），這是由于電極表面覆蓋了一層不導(dǎo)電的聚合膜，而洗脫后的印跡電極的響應(yīng)電流明顯增大 （曲線2），說明印跡電極中的印跡分子洗脫效果較好.再將洗脫后的印跡電極于5mmol／L的苯醚菊酯溶液中重新印跡5min，再次檢測電極的CV響應(yīng)，結(jié)果如圖1中曲線3所示，發(fā)現(xiàn)電極的響應(yīng)電流明顯減小 ，說明洗脫后的印跡電極對苯醚菊酯有較強的識別能力.

圖1 不同電極在2mmol／L的混合鐵鹽中的循環(huán)伏安曲線Fig.1 Cyclic voltammograms of different electrodes in 2mmol／L K3Fe（CN）6／K4Fe（CN）6solution

2.2 聚合溶劑的影響

聚合溶劑必須能溶解模板分子和功能單體，且盡量不影響模板分子和功能單體的穩(wěn)定性.合適的聚合溶劑使分子印跡聚合物有較好的柔韌性能，熱力學(xué)性能好的聚合溶劑有助于聚合物多孔結(jié)構(gòu)的形成和比表面積的增大.將不同的聚合溶劑制備的印跡電極洗脫模板分子后，于2mmol／L混合鐵鹽中得到的循環(huán)伏安曲線見圖2.當(dāng)用甲苯作聚合溶劑時，循環(huán)伏安曲線2所示，發(fā)現(xiàn)洗脫后的印跡電極和裸電極的電流響應(yīng)差不多，可能是甲苯作溶劑形成的聚合物結(jié)構(gòu)過于疏松，洗脫時很容易破壞聚合物的結(jié)構(gòu)；當(dāng)用V氯仿∶V甲醇＝4∶1作聚合溶劑，循環(huán)伏安曲線如圖中的曲線3，洗脫后其響應(yīng)電流很小，可能是用其作聚合溶劑，聚合物的結(jié)構(gòu)過于致密，很難將模板分子洗出；當(dāng)用乙腈作聚合溶劑時，如曲線4所示，洗脫后電極響應(yīng)電流比甲苯作溶劑時要小很多，但又比V氯仿∶V甲醇＝4∶1作溶劑要大很多，這說明乙腈作聚合溶劑既容易將模板分子洗出但又不影響聚合物的結(jié)構(gòu).綜合考慮，本實驗選擇乙腈作為聚合溶劑.

2.3 聚合溫度的影響

圖2 不同聚合溶劑制備的印跡電極洗脫后在2mmol／L混合鐵鹽中的CV響應(yīng)Fig.2 Cyclic voltammograms response of different imprinted electrodes prepared by different polymerization solvent in 2mmol／L K3Fe（CN）6／K4Fe（CN）6solution

圖3 不同聚合溫度制備的印跡電極的CV曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of different electrodes prepared at different temperature

制備分子印跡聚合物常用的引發(fā)方式有熱引發(fā)、光引發(fā)、電引發(fā)和輻射引發(fā)，本實驗選用熱引發(fā)方式.圖3為不同聚合溫度制備的印跡電極的CV曲線，1，2和3分別為印跡電極、洗脫后重新識別5 mmol／L苯醚菊酯的電極和洗脫后的印跡電極的電流響應(yīng)曲線.從圖3（a）中可以看出，當(dāng)引發(fā)溫度為50℃時，洗脫后的印跡電極的響應(yīng)電流變化不大，重新識別苯醚菊酯后電流響應(yīng)也沒變化，可能是引發(fā)溫度過低，聚合速率慢，使模板分子聚合過于緊密，使得模板分子很難洗出.從圖3（b）可以看出引發(fā)溫度為60℃時，洗脫后的印跡電極響應(yīng)電流明顯增大，說明模板分子得到了很好的洗脫，重新識別后響應(yīng)電流明顯減小，說明印跡電極對模板分子有很好的識別性能.圖3（c）的引發(fā)溫度為70℃，印跡電極本身的電流響應(yīng)比較大，洗脫后電流響應(yīng)有一定的增大，重新識別模板分子后電流響應(yīng)減小較少，可能是引發(fā)溫度過高，聚合速率過快，導(dǎo)致聚合進去的模板分子的數(shù)量減少，洗脫后印跡位點的數(shù)目較少.因此本實驗選擇的引發(fā)溫度為60℃.

圖4 印跡電極對不同濃度苯醚菊酯的差分脈沖伏安 （DPV）響應(yīng)曲線Fig.4 Differential pulse voltammetric curves of imprinted electrodes in different phenothrin concentrations

2.4 洗脫液的選擇

實驗選用丙酮、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇以及這些溶劑和乙酸按一定比例混合的混合溶液作為洗脫液，實驗表明選擇V丙酮∶V乙酸＝5∶1的 混合液為洗脫溶液能達到比較好的洗脫效果.

2.5 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

用同一印跡電極檢測1.0×10－5mol／L的苯醚菊酯溶液4次，其RSD為3.21%，說明該印跡電極有良好的重現(xiàn)性.將洗脫后的印跡電極放置3d，7 d和15d，然后再識別1.0×10－5mol／L的苯醚菊酯，其RSD為3.95%，說明制備的印跡電極有比較好的穩(wěn)定性.

2.6 印跡電極對不同濃度的苯醚菊酯的響應(yīng)

將洗脫后的印跡電極識別不同濃度苯醚菊酯溶液（溶劑為正己烷），然后掃差分脈沖伏安 （DPV）曲線，記錄其電流變化趨勢，結(jié)果如圖4所示，由圖可發(fā)現(xiàn)，印跡電極的電流響應(yīng)隨著苯醚菊酯濃度的增大而減小.內(nèi)插圖可以看出傳感器的響應(yīng)電流Δi（洗脫后印跡電極的電流響應(yīng)與識別苯醚菊酯后印跡電極的電流響應(yīng)之差）隨著苯醚菊酯濃度的增大而增大.響應(yīng)電流與苯醚菊酯的濃度在1.0×10－4～1.0×10－6mol／L的范圍內(nèi)成線性，其線性方程為Δi（μA）＝0.041 8×（μmol／L）＋2.270，相關(guān)系數(shù)為0.992 8，檢測下限為2.0×10－7mol／L.

2.7 印跡電極的選擇性

為驗證印跡電極的選擇性，實驗選擇了一些和模板分子結(jié)構(gòu)相近或者不同的有機物進行檢測，包括農(nóng)藥聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和馬拉硫磷.定義Δf／Δi為選擇性系數(shù)K，其中Δf為洗脫后印跡電極的電流響應(yīng)和印跡電極對濃度為1.0×10－5mol／L干擾物質(zhì)的電流響應(yīng)之差，Δi為洗脫后的印跡電極的電流響應(yīng)和印跡電極對濃度為1.0×10－5mol／L的苯醚菊酯的電流響應(yīng)之差，結(jié)果見表1.從表中可以看出，馬拉硫磷對苯醚菊酯檢測幾乎沒有干擾，和模板分子結(jié)構(gòu)相似的其他3種農(nóng)藥對苯醚菊酯有一定干擾，但干擾都比較小.說明制備的印跡電極具有較好的選擇性.

表1 印跡電極對干擾物質(zhì)的選擇性系數(shù)Tab.1 Selectivity coefficient of different compounds

2.8 樣品測定

取湘江水于燒杯中，用正己烷萃取，超聲振蕩5 min，靜置分層，分離，取上層液體.取1mL水樣加入1.5mL的離心管中，將洗脫掉模板分子的印跡電極置于其中5min，在2mmol／L的混合鐵鹽中掃DPV，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)電流變化不大，可能是其殘留低于傳感器的檢測限.采用加標(biāo)回收法驗證傳感器的準確性，一個樣品平行測定3次，測得結(jié)果如表2所示，回收率在95.62%～103.19%之間，說明傳感器具有較好的實際應(yīng)用價值.

表2 模擬水樣中苯醚菊酯的加標(biāo)回收實驗結(jié)果Tab.2 Recovery of phenothrin in imitative water samples

3 結(jié) 論

采用熱引發(fā)聚合的方法制備了以農(nóng)藥苯醚菊酯為模板的分子印跡電化學(xué)傳感器，實現(xiàn)了對農(nóng)藥苯醚菊酯的高靈敏檢測.實驗表明：該傳感器制備簡單，成本較低，可重復(fù)使用，選擇性較好，能達到快速靈敏的檢測農(nóng)藥苯醚菊酯的目的，并有望用于實際樣品的檢測.

[1] 陳海燕，王心如，肖繼皋，等.有機磷與擬除蟲菊酯農(nóng)藥的擬雌激素活性研究[J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2001，19（4）：274－277.CHEN Hai－yan，WANG Xin－ru，XIAO Ji－gao，etal.Research on the estrogenicity and pyrethroid pesticides[J].Chinese Journal of Industrial Hygiene and Occupational Diseases，2001，19（4）：274－277.（In Chinese）

[2] PERRY M J，VENNERS S A，BARR D B，etal.Environmental pyrethroid and organophosphorus insecticide exposures and sperm concentration[J].Reproductive Toxicology，2007，23（1）：113－118.

[3] 姚克文，王介東.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的男（雄）性生殖毒性研究進展[J].中華男科學(xué)雜志，2008，14（3）：268－271.YAO Ke－wen，WANG Jie－dong.Progress in studies of the male reproductive toxicity of pyrethroid insecticides[J].National Journal of Andrology，2008，14（3）：268－271.（In Chinese）

[4] GO V，GAREY J，WOLFF M S，etal.Estrogenic potential certain pyrethroid compounds in the MCF－7human breast carcinoma cell line[J].Environmental Health Perspectives，1999，107（3）：173－177.

[5] SCH?NING M J，KRAUSE R，BLOKE K，etal.A dual amperometric potentiometric FIA－based biosensor for the distinctive detection of organophosphorus pesticides[J].Sensors and Actuators B，2003，95（1－3），291－296.

[6] 閔紅，曲云鶴，李曉華，等.Au摻雜Fe3O4納米粒子酶傳感器的制備及其應(yīng)用于有機磷農(nóng)藥檢測的研究[J].化學(xué)學(xué)報，2007，5（20）：2303－2308.MIN Hong，QU Yun－h(huán)en，LI Xiao－h(huán)ua，etal.Au－doped Fe3O4nanoparticle immobilized acetylcholinesterase sensor for the detection of organophosphorus pesticide[J].Acta Chimica Sinica，2007，5（20）：2303－2308.（In Chinese）

[7] MAYES A G，WHITCOMBE M J.Synthetic strategies for the generation of molecularly imprinted organic polymers[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2005，57（12）：1742－1778.

[8] PRIEGO－CAPOTE F，YE L，SHAKIL S，etal.Monoclonal behavior of molecularly imprinted polymer nanoparticles in capillary electrochromatography[J].Analytical Chemistry，2008，80（8）：2881－2887.

[9] LI S H，WANG J，ZHAO M P.Cupric ion enhanced molecular imprinting of bovine serum albumin in hydrogel[J].Journal of Separation Science，2009，32（19）：3359－3363.

[10] ZHU X L，CAI J B，YANG J，etal.Films coated with molecular imprinted polymers for the selective stir bar sorption extraction of monocrotophos[J].Journal of Chromatography A，2006，1131（1－2）：37－44.

[11] ZHANG Y，LIU R J，HU Y L，etal.Microwave heating in preparation of magnetic molecularly imprinted polymer beads for trace triazines analysis in complicated samples[J].Analytical Chemistry，2009，81（3）：967－976.

[12] YAO J H，LI X，QIN W.Computational design and synthesis of molecular imprinted polymers with high selectivity for removal of aniline from contaminated water[J].Analytica Chimica Acta，2008，610（2）：282－288.