趙小英，謝敏敏，賀熱情，段桂芳，王麗群，李秀山，林建中，劉選明，2?

（1.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082；2.湖南大學(xué) 化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082）

WNK激酶（With no lysine kinase）是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，屬于蛋白激酶家族成員之一，因其家族成員在激酶功能域缺乏保守的賴氨酸而得名[1].該激酶家族成員在通常保守的位于激酶區(qū)域第二個(gè)亞結(jié)構(gòu)域缺乏一個(gè)賴氨酸殘基，動(dòng)物WNK激酶中賴氨酸被半胱氨酸所替代，在植物中常被天冬酰氨（N）或絲氨酸（S）替代，但激酶的生物活性沒(méi)有發(fā)生變化，因此表明WNK激酶是一種特殊的蛋白激酶[2].

Nakamichi等在雙子葉植物擬南芥中克隆到植物中第一個(gè)WNK基因AtWNK1，隨后又成功分離到了AtWNK2－98個(gè)WNK基因，并發(fā)現(xiàn)At－WNK2，AtWNK4，AtWNK6涉及擬南芥晝夜節(jié)律的調(diào)控過(guò)程[3].AtWNK2，AtWNK5，AtWNK8 的T－DNA插入突變導(dǎo)致擬南芥早開(kāi)花，AtWNK1的T－DNA插入突變表現(xiàn)出了晚花的表型[4].最新研究發(fā)現(xiàn)，破壞AtWNK8能提高擬南芥對(duì)鹽和滲透壓力的抗性[5].目前，在單子葉植物水稻中發(fā)現(xiàn)7個(gè)WNK基因，其中OsWNK1被發(fā)現(xiàn)參與各種非生物脅迫如冷、熱、鹽、干旱脅迫等[6].Wang等在大豆中鑒定了一個(gè)根特異性的WNK同源基因，Gm－WNK1，它通過(guò)與ABA分解代謝相關(guān)的蛋白GmCYP707A1相互作用微調(diào)ABA的水平，從而調(diào)控大豆晚期側(cè)根的發(fā)育[7].隨后又發(fā)現(xiàn)GmWNK1能增強(qiáng)植物對(duì)NaCl和滲透壓的抗性[8].目前，有關(guān)擬南芥AtWNK9基因的功能尚處于未知狀態(tài)，因此系統(tǒng)研究AtWNK9基因的功能對(duì)全面了解擬南芥WNK激酶的功能具有十分重要的意義.

生物信息學(xué)作為研究過(guò)程中的一項(xiàng)技術(shù)和開(kāi)發(fā)工具在核酸及蛋白質(zhì)序列分析及功能預(yù)測(cè)中發(fā)揮重要的作用.基因蛋白結(jié)構(gòu)與表達(dá)的生物信息學(xué)分析結(jié)果對(duì)后續(xù)基因功能研究有重要的指導(dǎo)意義[9].本研究采用生物信息學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的手段，對(duì)AtWNK9蛋白結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞以及基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析，這將為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料和載體

擬南芥野生型Col－4為哥倫比亞生態(tài)型，大腸桿菌DH5α菌株和pA7－YFP載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用簡(jiǎn)單模塊構(gòu)架搜索工具SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）（http：／／smart.embl－h(huán)eidelberg.de／smart／）和NCBI網(wǎng)站提供的保守結(jié)構(gòu)域檢索工具CDART（Conserved Do－main Architecture Retrieval Tool）（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／）對(duì) AtWNK9蛋白進(jìn)行保 守 結(jié) 構(gòu) 域 分 析[10－11]；利 用 丹 麥 科 技 大 學(xué)（DTU）的CBS服務(wù)器上的NetPhos2.0Server程序（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）分析磷酸化位點(diǎn)[12]；利用 WoLF PSORT 工具（http：／／wolfsort.seq.cbrc.jp）和 TAIR網(wǎng)站中提供的蛋白亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)庫(kù)SUBA（The SubCellular Proteomic Database）（http：／／suba2.plantenergy.uwa.edu.au／）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位[13－14]；通過(guò)TAIR網(wǎng)站中提供的 Arabidopsis eFP Browser鏈接（http：／／bbc.botany.utoronto.ca／efp／）分析At－WNK9基因的表達(dá)譜[15].利用植物Plant CARE在線分析工具（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／plantcare／）對(duì)AtWNK9基因上游1 000 bp的啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析[16].

1.3 35S：：AtWNK9－YFP融合表達(dá)載體構(gòu)建

以擬南芥野生型Col－4為材料，采用RT－PCR方法，首先提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以此cDNA 為 模 板 ，利 用 引 物AtWNK9－YFP－F（ACGCGTCGACATGATGAACAATCTC AGCCATCTT），AtWNK9－YFP－R（ GGACTAGTGT CTTCTTCGTCAGAG TCGTTT）（下劃線堿基部分分別為SalⅠ和SpeⅠ酶切序列），通過(guò)PCR擴(kuò)增得到AtWNK9目的基因的全長(zhǎng)cDNA序列.采用酶切連接的克隆方法，將該片段連接到pA7－YFP載體中，構(gòu)建綠色熒光蛋白與AtWNK9基因融合表達(dá)的載體35S：：AtWNK9－YFP.

1.4 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

為確定AtWNK9基因在細(xì)胞中表達(dá)的具體部位，將上述構(gòu)建的35S：：AtWNK9－YFP進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化.參照文獻(xiàn)[17]的方法，將未抽臺(tái)前的葉片約90片，切成1mm寬的長(zhǎng)條（長(zhǎng)度不定），置于500 mmol甘露醇溶液中.將細(xì)條撈出，置于含有纖維素酶和果膠酶的酶解液中，黑暗23℃，40～50r／min解析3h以制備原生質(zhì)體.取約10～20μg 35S：：AtWNK9－YFP質(zhì)粒于1.5mL離心管中，隨后依次加入100μL的原生質(zhì)體和110μL PEG／Ca溶液，輕柔混勻.放置20～30min后，去除PEG，用W5溶液（154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，2mM MES）終止反應(yīng)，然后置于云孔板內(nèi).23℃ 黑暗下培養(yǎng)6～18h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察和分析AtWNK9的亞細(xì)胞定位.

1.5 脅迫處理

擬南芥野生型Col－4種子經(jīng)深層（1% 次氯酸鈉10min，無(wú)菌水洗5次）消毒后，4℃ 春化3～4 d，然后播種在MS培養(yǎng)基上.放置在22～23℃培養(yǎng)箱連續(xù)白光培養(yǎng)12d后，用 ABA（100μM）[18]NaCl（300mM）[19]、葡萄糖（2%）[20]、熱（37 ℃）[21]、冷（4℃）[22]進(jìn)行處理，清水處理作為對(duì)照，在不同的時(shí)間點(diǎn)收取材料，液氮速凍后，于－80℃保存，用于后續(xù)的實(shí)時(shí)定量PCR分析.

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR分析

采用 TRIGene（GenStar）提取總 RNA，按照Maxima? First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）試劑盒提供的方法，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.在定量PCR儀（Mx3 000P）上，按照SYBR Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time）（TakaRa）定量試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行定量PCR.PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán).每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，持家基因ACTIN2作為分子內(nèi)標(biāo).本研究采用的定量PCR引物見(jiàn)表1.

表1 AtWNK9定量PCR引物Tab.1 AtWNK9quantitative PCR primers

2 結(jié) 果

2.1 AtWNK9蛋白結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用簡(jiǎn)單模塊構(gòu)架搜索工具SMART和NCBI中的CDART軟件對(duì)AtWNK9蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)AtWNK9在第25到第282個(gè)氨基酸區(qū)域，包含了一個(gè)保守的絲氨酸－蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域（STYKc）和一個(gè)蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（PKc）（圖1（a）），因此，AtWNK9被歸類(lèi)為絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶家族.利用丹麥科技大學(xué)（DTU）的CBS服務(wù)器上的Net－Phos2.0Server程序?qū)tWNK9蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析.從圖中可看出，AtWNK9蛋白氨基酸序列中的17個(gè)絲氨酸（S），2個(gè)蘇氨酸（Thr）和7個(gè)酪氨酸（Tyr）蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（圖1（b））.這說(shuō)明AtWNK9具有自身磷酸化的特點(diǎn).

圖1 AtWNK9蛋白保守結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析Fig.1 Analysis of conserved domain and phosphorylation sites of AtWNK9protein

2.2 AtWNK9基因亞細(xì)胞定位分析

采用WoLF PSORT工具對(duì)AtWNK9的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，得知AtWNK9定位在胞質(zhì)中；采用TAIR網(wǎng)站中提供的蛋白亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)庫(kù)SUBA進(jìn)行預(yù)測(cè)，得知該基因定位在細(xì)胞核中.為進(jìn)一步確定AtWNK9的亞細(xì)胞定位，我們采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法[17]進(jìn)行了分析研究.

首先，采用PCR擴(kuò)增，得到AtWNK9的全長(zhǎng)cDNA序列，大小為1 400bp左右（圖2（a））.用限制性內(nèi)切酶SaIⅠ和SpeⅠ將該片段和pA7－YFP載體進(jìn)行雙酶切，分別得到大小為4 900左右和1 400 bp左右的酶切片段（圖2（b））.回收酶切片段，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng).將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，然后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR和雙酶切（HindⅢ和BamHⅠ）鑒定，PCR產(chǎn)物及酶切片段大小與預(yù)期片段大小相一致（圖2（c），（d）），表明成功構(gòu)建了35S：：AtWNK9－YFP重組質(zhì)粒.隨后，以載體35S：：YFP質(zhì)粒作為對(duì)照，將重組質(zhì)粒35S：：At－WNK9－YFP轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，在熒光倒置顯微鏡下觀察融合基因的表達(dá)情況（圖3）.綠色熒光蛋白基因YFP在細(xì)胞的所有部位都高效表達(dá)（圖3（b）），融合基因AtWNK9－YFP則僅在細(xì)胞核中表達(dá)較強(qiáng)（圖3（d）），與蛋白亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)庫(kù)SUBA預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，表明AtWNK9編碼核蛋白.

圖2 35S：：AtWNK9－YFP融合表達(dá)載體構(gòu)建Fig.2 35S：：AtWNK9－YFPfusion expression vector construction

圖3 AtWNK9基因在擬南芥原生質(zhì)體中的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis ofAtWNK9 in protoplast ofArabidopsis

2.3 AtWNK9組織器官表達(dá)模式分析

基因的時(shí)空表達(dá)模式可為預(yù)測(cè)和研究其生物學(xué)功能提供參考依據(jù).根據(jù)TAIR網(wǎng)站中eFP Browser連接提供的數(shù)據(jù)，對(duì)AtWNK9基因在擬南芥不同組織器官中的表達(dá)譜進(jìn)行了分析整理（圖4（a））.AtWNK9基因在擬南芥植株的根、下胚軸、葉、花等各個(gè)組織器官中均有不同水平的表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高.此外，AtWNK9在不同部位的葉片、莖、花和花粉中的表達(dá)也存在一定的差異但表達(dá)水平都比較低（圖4（a））.為了進(jìn)一步確定AtWNK9基因在不同組織器官的表達(dá)模式，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了該基因在擬南芥根、蓮座葉、莖生葉、莖、花和果莢中的表達(dá)情況.從圖4（b）中可看出，AtWNK9在所有被檢測(cè)的組織器官中均有表達(dá)，其中在根中的表達(dá)量最高，約為其它器官中的3～5倍，其次為莖.這與eFP Browser連接提供的數(shù)據(jù)基本一致，推測(cè)AtWNK9可能參與根的生長(zhǎng)發(fā)育.

圖4 AtWNK9基因在擬南芥不同組織器官中的表達(dá)Fig.4 Expression ofAtWNK9in different organs ofArabidopsis

2.4 AtWNK9基因表達(dá)對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

利用植物啟動(dòng)子順式作用元件分析網(wǎng)站Plant CARE在線分析了AtWNK9基因上游1 000bp的調(diào)控區(qū)域.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AtWNK9基因的調(diào)控區(qū)域存在大量激素響應(yīng)與脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，包括赤霉素反應(yīng)元件（Gibberellin－Responsive Element，GARE）、熱脅迫響應(yīng)元件（HSE）、逆境和脅迫響應(yīng)元件（TC－rich－repeats）等順式作用元件.

為了研究AtWNK9基因的表達(dá)是否響應(yīng)激素、逆境脅迫，實(shí)驗(yàn)中對(duì)12齡擬南芥幼苗分別進(jìn)行ABA、鹽、葡萄糖、熱、冷脅迫處理，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析了AtWNK9基因的表達(dá)情況.結(jié)果如圖5所示，AtWNK9基因的表達(dá)受脅迫處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其中ABA的誘導(dǎo)效應(yīng)最明顯，AtWNK9的轉(zhuǎn)錄水平在ABA處理4h即達(dá)到峰值，為對(duì)照處理的8～9倍，在隨后的8h內(nèi)其表達(dá)量仍然維持較高的水平；AtWNK9基因?qū)aCl處理的響應(yīng)更快，在處理2h達(dá)到最大值，為對(duì)照處理的8～9倍左右，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)AtWNK9基因的表達(dá)量迅速下降，但仍為對(duì)照處理的2～3倍；AtWNK9對(duì)葡萄糖、熱、冷脅迫的響應(yīng)相對(duì)較弱，分別在葡萄糖處理4h，熱、冷處理6h達(dá)到最大值，為對(duì)照處理的5倍、3倍和6倍；AtWNK9對(duì)水處理（對(duì)照實(shí)驗(yàn)）幾乎沒(méi)有響應(yīng)，說(shuō)明AtWNK9基因?yàn)橹参锩{迫反應(yīng)相關(guān)基因.

圖5 脅迫處理擬南芥幼苗中AtWNK9基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR分析Fig.5 Real－time quantitative PCR analysis ofAtWNK9gene expression in stress－treatedArabidopsisseedling

3 討 論

對(duì)基因的生物信息學(xué)分析，可為預(yù)測(cè)其生物學(xué)功能提供參考.本研究首先利用生物信息學(xué)的手段對(duì)AtWNK9的核苷酸及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)AtWNK9基因包含與蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（PKc＿）和絲氨酸－蘇氨酸催化結(jié)構(gòu)域（STYKc）具有高度相似性的結(jié)構(gòu)域，且存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，與WNK激酶家族中其他成員的結(jié)構(gòu)特征一致[23]，因此，AtWNK9具有自身磷酸化特點(diǎn)，這還需作進(jìn)一步研究.

基因的表達(dá)部位及表達(dá)模式通常與基因的功能有緊密的聯(lián)系.結(jié)合生物信息學(xué)分析、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及熒光定位分析，得知AtWNK9在細(xì)胞核中表達(dá)，說(shuō)明AtWNK9基因編碼核蛋白.此外，根據(jù)eFP Browser提供的數(shù)據(jù)及實(shí)時(shí)定量PCR分析，證明了AtWNK9基因在擬南芥根中高效表達(dá)，這與Wang等的RT～PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合[4]，說(shuō)明AtWNK9可能參與根的生長(zhǎng)發(fā)育.

利用Plant CARE對(duì)AtWNK9啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：?jiǎn)?dòng)子區(qū)域存在大量激素響應(yīng)與脅迫響應(yīng)相關(guān)元件.通過(guò)激素和脅迫處理發(fā)現(xiàn)，AtWNK9基因的表達(dá)受ABA，NaCl等非生物脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，說(shuō)明AtWNK9為非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)基因.這為進(jìn)一步研究AtWNK9基因的生物學(xué)功能奠定了良好基礎(chǔ).

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