王生瑜，袁小平

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，蘭州 730020；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院正畸科／瀘州醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)和再生實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000）

研究認(rèn)為正畸炎性牙根吸收可以達(dá)3%～100%，但其可以部分自行修復(fù)［1］。牙根修復(fù)是骨吸收與重建的平衡過程，機(jī)制相對(duì)復(fù)雜：牙骨質(zhì)吸收及重新沉積，牙周組織的修復(fù)均參與其中［2］。甲狀旁腺素（PTH）是重要的骨代謝調(diào)節(jié)劑，研究證明間斷應(yīng)用少量PTH（1－34）利于骨組織的修復(fù)［3］，但它能否對(duì)牙根修復(fù)期持續(xù)進(jìn)行的牙根吸收產(chǎn)生影響鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)以正畸誘導(dǎo)牙根吸收后的大鼠為研究對(duì)象，不同時(shí)間段皮下間斷注射少量PTH（1－34）后，免疫組織化學(xué)測定牙根修復(fù)期壓力側(cè)牙周組織中核因子κB受體活化因子配體（RANKL）表達(dá)變化規(guī)律，特殊染色計(jì)數(shù)牙根吸收面破骨細(xì)胞的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用6～8周雄性，體質(zhì)量200～250g SD大鼠63只（屬清潔級(jí)I級(jí)合格動(dòng)物，由重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠正畸牙根吸收模型的建立 隨機(jī)選取大鼠一側(cè)上頜第一磨牙為實(shí)驗(yàn)牙。在大鼠上頜前牙與第一磨牙之間安裝一個(gè)0.012英寸的鎳鈦拉簧，加載0.6N的力，使上頜第一磨牙向近中移動(dòng)10d，建立牙根吸收模型。實(shí)驗(yàn)牙移動(dòng)10d后拆除移動(dòng)裝置，對(duì)大鼠重新稱體質(zhì)量，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組21只。體質(zhì)量采用方差分析進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)比較，結(jié)果表明3組動(dòng)物的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2.2 PTH（1－34）注射實(shí)驗(yàn) 拆除裝置后做如下的實(shí)驗(yàn)處理：空白對(duì)照組不注射任何藥品；陰性對(duì)照組自拆除裝置當(dāng)日起在皮下注射6mL／kg生理鹽水，以后隔日注射；實(shí)驗(yàn)組拆除裝置自當(dāng)日起在皮下注射6mL／kg PTH（1－34）和生理鹽水，以后隔日注射［5］。3組均在07、10、14、17、21、25d分別處死3只取材。

1.2.3 標(biāo)本制備和染色 取實(shí)驗(yàn)側(cè)上頜骨包括3個(gè)完整的磨牙及牙根、牙槽骨的組織。固定，脫鈣，石蠟包埋，沿牙體長軸，按施力方向的近遠(yuǎn)作3～5mm厚的連續(xù)切片。免疫組織化學(xué)檢測RANKL的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用山羊RANKL多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），SP免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）按說明書步驟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。陽性標(biāo)準(zhǔn)：胞漿為特異性棕黃色，陽性細(xì)胞著色水平明顯高于背景水平。

1.2.4 RANKL免疫組織化學(xué)表達(dá)測定 光鏡下在實(shí)驗(yàn)牙顯示中央根及遠(yuǎn)中根吸收面壓力側(cè)牙周組織15個(gè)高倍鏡視野（×200），經(jīng)攝像后，Image－pro－plus圖像分析系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)中編輯處理，測得牙根吸收陷窩及臨近牙周組織RANKL表達(dá)陽性染色區(qū)域的平均光密度值。

1.2.5 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色破骨細(xì)胞檢測 采用Nikon ECLIPES TE2000－S多功能全自動(dòng)顯微鏡對(duì)大鼠TRAP染色切片進(jìn)行觀察，并用Nikon DXM 1200C數(shù)碼相機(jī)在第一磨牙中央根與遠(yuǎn)中根牙根吸收面隨機(jī)選取采集各時(shí)像點(diǎn)15個(gè)高倍鏡視野（×200），計(jì)數(shù)TRAP陽性染色的破骨細(xì)胞數(shù)，計(jì)算均數(shù)。以紅色顆粒代表TRAP陽性的信號(hào)，TRAP陽性染色胞核在3個(gè)或3個(gè)以上的且位于第一磨牙中央根與遠(yuǎn)中根根中區(qū)及附近根尖區(qū)牙根吸收面的細(xì)胞計(jì)數(shù)為陽性破骨細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；同組不同時(shí)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)楞個(gè)木素－伊紅（HE）染色后光鏡下觀察結(jié)果 中斷加10d牙根吸收陷窩均未見修復(fù)性牙骨質(zhì)沉積。10d時(shí)牙根吸收陷窩邊緣開始出現(xiàn)一層紫染的修復(fù)性牙骨質(zhì)沉積線。見圖1。

圖1 10d牙根面牙骨質(zhì)修復(fù)情況光鏡檢查（HE×200）

2.2 RANKL免疫組織化學(xué)表達(dá)測定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組7、10dRANKL表達(dá)顯著增強(qiáng)，21d起表達(dá)顯著減弱。見圖2、3。比較3組0、7、10、14、17、21、25d牙根面吸收陷窩及臨近牙周組織中RANKL表達(dá)光密度值發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組組間比較7、10、21、25d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

圖2 實(shí)驗(yàn)組RANKL表達(dá)7d（×200）

圖3 實(shí)驗(yàn)組RANKL表達(dá)21d（×200）

表1 牙根壓力側(cè)RANKL表達(dá)平均光密度值（）

表1 牙根壓力側(cè)RANKL表達(dá)平均光密度值（）

a：P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；b：P＜0.01，與陰性對(duì)照組組比較。

空白對(duì)照組 陰性對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組0 0.1461±0.00010.1463±0.00030.1464±0.0003時(shí)間（d）7 0.1722±0.00030.1728±0.00040.2067±0.0004ab 10 0.2365±0.00030.2368±0.00020.2669±0.0004ab 14 0.1943±0.00030.1943±0.00020.1943±0.000217 0.2328±0.00010.2322±0.00040.2324±0.000321 0.2119±0.00020.2120±0.00170.1871±0.0005ab 25 0.2020±0.00010.2030±0.00020.1786±0.0005ab

2.3 TRAP染色破骨細(xì)胞檢測結(jié)果 TRAP染色0d，壓力側(cè)根面及牙周組織中可見大量陽性染色破骨細(xì)胞定位于破牙或破骨細(xì)胞的胞漿內(nèi)，見圖4。0、7、10、14、17、21、25d牙根面吸收陷窩及臨近牙周組織中破骨細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組組間對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖4 TRAP染色0d破骨細(xì)胞（×200）

表2 牙根面吸收陷窩及臨近牙周組織中破骨細(xì)胞數(shù)（）

表2 牙根面吸收陷窩及臨近牙周組織中破骨細(xì)胞數(shù)（）

時(shí)間（d） 空白對(duì)照組 陰性對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組0 11.003±0.02511.040±0.03411.050±0.0207 5.310±0.017 5.340±0.051 5.350±0.04410 3.110±0.035 3.260±0.606 2.980±0.04614 1.350±0.030 1.370±0.036 1.360±0.05217 0.260±0.030 0.280±0.010 0.260±0.03621 0.230±0.010 0.240±0.065 0.250±0.02025 0.240±0.026 0.210±0.036 0.230±0.026

3 討 論

正畸過程中常見的牙根吸收是由牙齒移動(dòng)引起的醫(yī)源性并發(fā)癥，怎樣減少牙根吸收是近年來正畸醫(yī)生比較關(guān)注的焦點(diǎn)。PTH是重要的鈣、磷調(diào)節(jié)因子，間歇給藥有促進(jìn)骨形成作用［3］。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)選擇皮下小劑量間斷注射給藥途徑，以觀察在大鼠牙根修復(fù)期是否通過成骨作用抑制修復(fù)期仍持續(xù)的牙根吸收。

本實(shí)驗(yàn)選用0.5N的力持續(xù)移動(dòng)實(shí)驗(yàn)牙齒10d復(fù)制牙根吸收模型。結(jié)果在實(shí)驗(yàn)的早期（即0～14d），3組均可見牙根面有破骨細(xì)胞出現(xiàn)且都呈現(xiàn)遞減趨勢，說明牙根吸收模型復(fù)制成功；去除加力裝置后牙根吸收均未停止，這與文獻(xiàn)［6－7］的研究結(jié)果相似，是因?yàn)檎詨毫νＶ购?，透明樣化組織區(qū)仍存在持續(xù)吸收，以達(dá)到根吸收范圍與透明樣化區(qū)的最大范圍一致，證明隨著中斷加力時(shí)間的延長，牙根吸收是逐漸向修復(fù)轉(zhuǎn)變的。RANKL是破骨細(xì)胞活性標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)全身間斷運(yùn)用PTH后大鼠壓力側(cè)牙周組織中RANKL的表達(dá)相對(duì)于未注射PTH組的實(shí)驗(yàn)大鼠牙周組織中變化顯著，呈現(xiàn)早期升高晚期降低，證明小劑量間斷應(yīng)用PTH（1－34）對(duì)牙周組織中RANKL表達(dá)產(chǎn)生了影響。早期升高是因?yàn)镻TH發(fā)揮成骨作用需要破骨細(xì)胞的參與，刺激了破骨及破牙骨質(zhì)細(xì)胞的成熟和活性［8－9］；后期RANKL表達(dá)減弱是因?yàn)镻TH發(fā)揮了成骨作用，這與Lossd?rfer等［10］觀點(diǎn)一致，其細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明間斷應(yīng)用PTH可以抑制牙周組織中破骨細(xì)胞的分化；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PTH對(duì)破骨細(xì)胞及破牙骨質(zhì)細(xì)胞數(shù)目變化沒能產(chǎn)生有效影響，分析原因可能是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有區(qū)別：牙周組織對(duì)外源性PTH（1－34）有清除作用［11］，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)皮下注射進(jìn)入體內(nèi)的PTH（1－34）量很少導(dǎo)致早期PTH（1－34）在牙周組織中的劑量有限，作用較微弱，不能對(duì)吸收陷窩中破牙骨質(zhì)細(xì)胞及臨近牙周組織中破骨細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生有效影響，因此對(duì)于修復(fù)早期仍持續(xù)存在的牙根吸收未產(chǎn)生明顯抑制作用；可是隨著時(shí)間的延長晚期PTH（1－34）的量在牙周組織中大量積聚對(duì)RANKL的表達(dá)產(chǎn)生了抑制作用，這可能利于打破骨平衡使得其向成骨轉(zhuǎn)化，有待后續(xù)研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說明通過皮下間斷少量運(yùn)用PTH對(duì)修復(fù)早期仍持續(xù)的牙根吸收不能產(chǎn)生抑制作用。

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