劉志剛，吳 彥，孫青松

（1.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)院，安徽安慶246011；2.吉林大學(xué)人獸共患病研究所教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130062）

華支睪吸蟲病是一種人獸共患寄生蟲病，由于其成蟲寄生于人、貓、犬等動物的膽囊和膽管內(nèi)，可引起膽管及其周圍組織的炎癥反應(yīng)誘發(fā)肝硬化、原發(fā)性肝癌等嚴(yán)重病變［1-8］。目前，華支睪吸蟲的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、流行病學(xué)和病原鑒定等方面，對其不同發(fā)育階段主要集中在成蟲或囊蚴的研究，而對華支睪吸蟲蟲卵的研究甚少，蟲卵的研究只限于形態(tài)學(xué)研究。本試驗(yàn)利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測人糞便中的蟲卵診斷人是否患有華支睪吸蟲病，為進(jìn)一步探索PCR技術(shù)在華支睪吸蟲病診斷中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞樣 來自安徽省蕪湖縣流行區(qū)村民新鮮糞便。

1.1.2 儀器 Gene Amp PCR systerm 9700，AB公司產(chǎn)品；AR1140電子天平，USA奧豪斯公司產(chǎn)品；PY-120水平脫色搖床，北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心產(chǎn)品；CX31RTSF生物顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；NANODROP2000，Thermo公司產(chǎn)品；水浴鍋，超凈工作臺，磁力攪拌器，振蕩器，組織勻漿機(jī)。

1.1.3 主要試劑 20mL／L Triton X-100，KOH，蔗糖／KCl溶液，PCR 擴(kuò)增 試劑，T 載體，DNA Marker，瓊脂糖，DNA凝膠回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 糞便的收集與保存 鏡檢糞便發(fā)現(xiàn)華支睪吸蟲蟲卵，初步確定為陽性糞便，需要進(jìn)一步鑒定。

1.2.2 蟲卵DNA的提取 參考Boris Müller［9］并進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。

將冰凍的含蟲卵的糞便樣品取出，于清水中融化，放入沸水中煮6min，10 000r／min離心6min，去除少量上清后，將所有液體移入2mL的EP管中，并重懸；將2mL的EP管放入沸水中煮5min，10 000r／min離心5min；去上清，計算管內(nèi)樣品重量，各管分別加入20mL／L Triton X-100，KOH各200μL，振蕩器震蕩混勻，10 000r／min離心5min，去上清，反復(fù)進(jìn)行此過程，直至上清變清澈；去上清，每管加入800μL蔗糖／KCl溶液，并充分震蕩均勻后，12 000r／min離心10min；將上清移入新的2 mL EP管中，加滿水，12 000r／min離心10min，去上清，重復(fù)加滿水，清洗沉淀，最后殘留300μL沉淀物及液體；用組織勻漿機(jī)勻漿殘留的沉淀物及液體，10 000r／min離心1min，每管；最后10 000r／min離心5min，留取上清，移入新管中，沸水煮5min，作為PCR模板。

1.2.3 引物的設(shè)計與PCR條件的優(yōu)化 根據(jù)華支睪吸蟲基因（AF217094）設(shè)計引物，上游引物Cs1：5′-TGGCCTGACTGGCTGGCCGG-3′，下 游 引 物Cs2： 5′-CGGCACCCCACACACATACA-3′， 用Primer 5.0分析軟件分析其可行性，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer液（含Mg2＋），2mmol／L dNTP，10pmol／L上、下游引物，DNA模板，5U／μLTaqDNA聚合酶，滅菌去離子水混至50μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃30s，55℃～60℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測 用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳緩沖液為0.5×TBE，加入少許溴化乙錠（EB）使其終濃度為0.5 μg／mL。將上樣緩沖液與擴(kuò)增產(chǎn)物以1∶6的比例混勻，加樣至樣品孔中，以DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量。用5V／cm的電壓進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)至適當(dāng)位置后，切斷電源，在紫外投射反射儀上觀察電泳結(jié)果并拍照。

1.2.5 連接載體與基因測序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大量回收，用DNA凝膠回收試劑盒回收DNA，與T載體連接后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定，應(yīng)用NCBI中的BLAST工具將測序結(jié)果與基因庫內(nèi)的基因序列進(jìn)行比對并進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 蟲卵鏡檢結(jié)果

顯微鏡下可看見黃褐色蟲卵，前窄后鈍，形似芝麻粒。一端有明顯的卵蓋，蓋側(cè)有稍厚隆起的肩峰，對端有1個疣狀小結(jié)節(jié)，卵內(nèi)含1個梨形的毛蚴。

2.2 PCR優(yōu)化結(jié)果

分別對PCR反應(yīng)體系中的dNTP量，模板量，引物量和TaqDNA聚合酶用量進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳結(jié)果（表1）；擬在55℃～60℃的區(qū)間內(nèi)，對退火溫度進(jìn)行摸索。結(jié)果最佳反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃結(jié)束反應(yīng)。用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定成功后回收，用15g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產(chǎn)物。檢測結(jié)果顯示，除陰性對照未見條帶外，其余各樣本均可擴(kuò)增出大小約為255bp的特異性條帶（圖1、圖2）。

表1 優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系Table 1 The optimized PCR system

圖1 PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results

圖2 回收產(chǎn)物鑒定結(jié)果Fig.2 The identification results of recovered products

2.3 基因序列對比結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果應(yīng)用BLAST工具進(jìn)行比對后，發(fā)現(xiàn)其與華支睪吸蟲基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）：中國沈陽分離株（AF217099）和朝鮮分離株（AF217094）的同源性為100%，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物為華支睪吸蟲基因的其中一個片段。

3 討論

華支睪吸蟲蟲卵比較小，不易檢查，容易漏診，目前主要依靠顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察，免疫學(xué)診斷方法最近幾年有了快速的發(fā)展，具有高特異性、高敏感性、簡便易行等優(yōu)勢，然而由于華支睪吸蟲抗原的復(fù)雜性以及不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄與表達(dá)產(chǎn)物的不同，致使高特異性及高敏感性抗原至今尚未尋找到，從而使這一優(yōu)勢診斷方法始終未應(yīng)用到臨床診斷中。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）因其較高的敏感性、特異性以及能夠提供病原體在體內(nèi)存在的直接證據(jù)，在其診斷中展示了廣闊的應(yīng)用前景［10-11］。本試驗(yàn)應(yīng)用PCR技術(shù)檢測糞便中華支睪吸蟲蟲卵DNA，因糞便中干擾因素較多，故基因組DNA的成功提取以及穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系的建立便成為開展該方面研究的前提，同時探索PCR檢測法的敏感性，為進(jìn)一步探索分子生物學(xué)方法在華支睪吸蟲病診斷中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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