牟 亞，張 郁，西格基，聶艷如，陳朝喜＊

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.黑水縣畜牧獸醫(yī)局，四川阿壩623500）

抗生素在促進(jìn)動物生長和提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益等方面發(fā)揮了重要作用，然而由于其廣泛應(yīng)用尤其是不合理使用和濫用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性并帶來了很多新的問題［1］。世界衛(wèi)生組織（WHO）提出2012年將重點(diǎn)控制抗生素耐藥性問題，因?yàn)榭缭絼游?、人和生態(tài)系統(tǒng)的疾病很多，60%對人構(gòu)成危險的病原體來源于動物，并且可能引起人和動物發(fā)生嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件，因此迫切需要加強(qiáng)和改善公共健康與動物健康系統(tǒng)之間的關(guān)系［2］。相關(guān)研究表明，由于中藥的特殊性，細(xì)菌對中藥尤其是中藥復(fù)合制劑不易產(chǎn)生耐藥性［3］。

烏樟（Berberis julianae Schneid）又稱香樟，在我國主要分布于長江以南及西南地區(qū)，尤其以四川省宜賓地區(qū)生長面積最廣。除了具有凈化有毒空氣能力和用作建筑材料外，其含有的松油二環(huán)烴、樟腦烯、檸檬烴、丁香油酚等化學(xué)物質(zhì)具有抗癌、防蟲和治療腹痛和皮膚瘙癢等功效［4-5］。

蠔豬刺（Cinnamomum camphora （L.）Presl）屬小檗堿科，主要分布我國湖北、四川、貴州、湖南、廣西等省份，其中四川涼山州地區(qū)有十幾種，在四川涼山和貴州省民間常用燒傷、腹瀉等濕熱疾病的治療驗(yàn)方［6-7］。

本文旨在初步探討蠔豬刺和烏樟及其與常用抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用對禽源沙門菌及大腸埃希菌的體外抗菌作用，以期探究其對兩種常見的禽類病原菌的抑制或殺滅效果，并分析其延緩細(xì)菌抗生素產(chǎn)生耐藥性的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 蠔豬刺采自四川省巴中市南江縣的叢林中；烏樟采自湖北省利川市市區(qū)的綠化帶；抗菌藥物（大觀霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、林可霉素和替米考星）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，所有抗菌藥物臨用前配成5 120μg／mL的母液備用。

1.1.2 菌株 大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922由西南民族大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)教研室保存。試驗(yàn)中所用的沙門菌和大腸埃希菌采自四川省成都市洛帶古鎮(zhèn)某養(yǎng)殖場的跑山雞糞便，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離純化得到純化菌株。

1.2 方法

1.2.1 蠔豬刺和烏樟水提物的制備 分別將采集的蠔豬刺和烏樟樣品適當(dāng)清洗，除去表面的污漬和泥沙，剪成約2cm長短的小段后37℃烘干后備用。取烏樟干品1kg，蒸餾水浸泡2h后煮沸，文火煎煮30min，反復(fù)3次，最后濾出煎液，合并3次煎煮液后濃縮定容至1 000mL，使水提物相當(dāng)于干物質(zhì)含量為1g／mL，121℃高溫滅菌20min后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。在蠔豬刺水提物的制備過程中其煎煮步驟同烏樟，取蠔豬刺4.0kg，最后定容至1 000 mL，使水提物相當(dāng)于干物質(zhì)含量為4g／mL，121℃高壓滅菌20min后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液的制備 將標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922和純化后的禽源大腸埃希菌和沙門菌的菌種經(jīng)LB肉湯增殖24h后，制成含菌數(shù)約為105cfu／mL～106cfu／mL的菌懸液。

1.2.3 MIC和FIC測定 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦的微量肉湯稀釋法對蠔豬刺和烏樟水提物及大觀霉素等抗菌藥物進(jìn)行最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）的測定。

1.2.3.1 最小抑菌濃度測定 具體操作步驟如下：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板前11列各孔加100μL MH肉湯，然后分別在第1、2列的第1孔加入100μL藥物A，依次倍比稀釋至第11列，第1、2列的前11孔各加入100μL制備好的菌懸液。同樣，在第3、4列加入100μL藥物B，依次倍比稀釋至第11列，最后第3、4列的前11孔各加入100μL制備好的菌懸液。37℃培養(yǎng)16h～24h后，計(jì)算MIC。臨床共分離到的11株大腸埃希菌和16株沙門菌，每個菌株對每個藥物做兩個重復(fù)。

1.2.3.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 棋盤稀釋法進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的步驟如下：96孔細(xì)胞板的前8列各孔加入100μL MH肉湯，在第1列各孔加100μL藥物A，依次倍比稀釋至第8列，最后吸出100μL加入第9列，同樣在第一行前8孔各加100μL藥物B，依次倍比稀釋至第8行，最后在前10列各孔加入100μL制備好的菌懸液，37℃培養(yǎng)16h～24h后，計(jì)算FIC。因大觀霉素、環(huán)丙沙星對沙門菌、大腸埃希菌、標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922的MIC值均為該藥的最小稀釋濃度，故聯(lián)合藥敏試驗(yàn)只做其余的藥物。此外，聯(lián)合藥敏試驗(yàn)只做標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922。

2 結(jié)果

蠔豬刺、烏樟和抗菌藥物對沙門菌和大腸埃希菌的MIC范圍、MIC50和MIC90如表1所示，從中可以看出，蠔豬刺和烏樟對沙門菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度均為1g／mL，其他抗菌藥物對沙門菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度在NCCLS提供的質(zhì)控范圍內(nèi)。

雖然蠔豬刺和烏樟對大腸埃希菌的最小抑菌濃度一樣，但當(dāng)兩種中藥分別與抗菌藥物及另一種中藥聯(lián)合用藥時，表現(xiàn)出不同的抗菌作用。從表2可以看出，蠔豬刺-紅霉素、烏樟-紅霉素、烏樟-替米考星、烏樟-林可霉素聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)為相加作用；蠔豬刺-林可霉素，烏樟-蠔豬刺聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)為無關(guān)作用；蠔豬刺-替米考星聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出無關(guān)作用。

表1 蠔豬刺、烏樟和抗菌藥物對沙門菌和大腸埃希菌的MIC范圍、MIC50和MIC90Table 1 MIC range，MIC50and MIC90of E.coli and Salmonellato Berberis julianae，Cinnamomum camphora and antimicrobials

表2 蠔豬刺、烏樟水提物和抗菌藥物聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Combined antimicrobial susceptibility test results of Berberis julianae，Cinnamomum camphora and antimicrobials

3 討論

3.1 煎煮過程對烏樟和蠔豬刺有效成分的影響

在煎煮過程中，烏樟和蠔豬刺中某些有效成分可能會有不同程度的損失，導(dǎo)致藥物抑菌能力與抗生素相比不是十分理想，其主要原因是藥物的有效成分不溶于水或者藥物的有效成分性質(zhì)不穩(wěn)定，在遇到熱源時易遭到破壞，導(dǎo)致其抑菌能力差，從而對試驗(yàn)結(jié)果造成一定影響，因此如何排除煎煮過程中各因素對中藥抑菌效果的發(fā)揮至關(guān)重要。

3.2 水提法提取烏樟和蠔豬刺優(yōu)缺點(diǎn)分析

水提法較其他提取方法具有設(shè)備簡單、成本低、操作簡便易行等優(yōu)點(diǎn)，尤其是中藥提取物往往是多種成分的混合物，抑菌效果可能是各種成分共同發(fā)揮作用的結(jié)果，因此水提法廣泛應(yīng)用于植物藥材有效成分的初步提取。在本試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)中，采用水提法對烏樟和蠔豬刺根、莖和葉子等不同部位分別進(jìn)行提取比較，其抑菌效果相差不大，在一定程度上可以保證試驗(yàn)的順利進(jìn)行。

3.3 中草藥飼料添加劑在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用

大量試驗(yàn)證實(shí)，中草藥中含有蛋白質(zhì)、糖類、酯類、維生素、微量元素、鞣質(zhì)、色素、皂苷等物質(zhì)［9-11］，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防和治療畜禽疾病、增進(jìn)機(jī)體新陳代謝能力、促進(jìn)蛋白質(zhì)和酶的合成以及提高動物生產(chǎn)性能等多重功效［12-13］。針對烏樟和蠔豬刺分布區(qū)域比較廣和采集方便等優(yōu)點(diǎn)，我們設(shè)想是否可以考慮將蠔豬刺和烏樟作為中草藥飼料添加劑，充分發(fā)揮其無毒、無害、低殘留且不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，還可大大增強(qiáng)家禽的免疫力，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。因此，在下一步的試驗(yàn)中將繼續(xù)研究其體內(nèi)抑菌效果以及其對細(xì)菌性感染疾病的防治，從而為其后續(xù)研究奠定一定基礎(chǔ)。

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