金 彪，伍成奇，唐 攀，邱淵皓，劉萬(wàn)華，武 寧，王晶鈺

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

β-內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類、碳青霉烯類和青霉烯類酶抑制劑等。頭孢菌素類抗生素是從頭孢菌素的母核7-氨基頭孢烷酸連接不同側(cè)鏈而制成的半合成抗生素。藥物首先發(fā)現(xiàn)于1945年［1］，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的實(shí)驗(yàn)室研究，于1963年被正式應(yīng)用于臨床當(dāng)中，并且根據(jù)臨床的應(yīng)用情況不斷改進(jìn)。由于頭孢菌素類抗生素的廣泛應(yīng)用，其耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，給臨床治療帶來(lái)了困難。大腸埃希菌（E.coli）產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制，由質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）是新一代β-內(nèi)酰胺酶類抗生素耐藥的主要原因，使包括第三代頭孢菌素在內(nèi)的多種β-內(nèi)酰胺類抗生素失活，還能水解第四代頭孢菌素以及單環(huán)類抗生素的質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamases，BLA）［2-3］。ESBLs是由質(zhì)粒介導(dǎo)的，它可以通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式獲得或轉(zhuǎn)移耐藥基因。根據(jù)ESBLs基因和蛋白質(zhì)的同源性將其分為四類，即TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型酶［4］，本次研究采用了前三類酶。目前，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是E.coli對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制，醫(yī)學(xué)研究較多，但國(guó)內(nèi)獸醫(yī)臨床鮮有報(bào)道。因此，本研究目的是了解雞源致病性E.coli對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥情況及耐藥基因與耐藥性的相關(guān)性，旨在為臨床合理用藥以及E.coli耐藥機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源及其培養(yǎng) 108株雞源致病性E.coli，2012年8月～10月先后分離自陜西省幾個(gè)主要規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)的雞群。無(wú)菌操作采集上述規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)的雞群疑似感染E.coli的病、死雞肺臟、肝臟樣本，接種麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基初步分離，通過(guò)培養(yǎng)特性觀察、生化試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)共分離鑒定出108株致病性E.coli，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物性食品衛(wèi)生檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及藥敏紙片 麥康凱瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；7種β-內(nèi)酰胺類藥敏紙片（頭孢派酮、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢呋肟、頭孢噻吩），購(gòu)自杭州天和微生物試劑公司。

1.1.3 主要試劑 PCR Master Mix（含Taq DNA聚合 酶、dNTP、PCR buffer）、DNA Marker DL 2 000，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；NaCl，購(gòu)自四川西隴化工有限公司；酵母提取物和胰蛋白胨，購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；溴化乙錠（100mg），購(gòu)自廣州寶泰克生物科技有限公司；瓊脂糖，西班牙Biowest公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.1.4 耐藥基因引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因序列，用Primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶tem、ctx-m和shv的3種特異性引物，設(shè)計(jì)的引物序列見表1。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 The primers for PCR amplification

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的藥物敏感性試驗(yàn) 參照CLSI（clinical and laboratory standards institute）推薦的K-B藥敏紙片法對(duì)108株雞源致病性E.coli進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，判定結(jié)果參照CLSI手冊(cè)中藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)［5］。

1.2.2 耐藥基因的PCR擴(kuò)增 將待檢菌株劃線接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24h，挑取菌落溶于500μL無(wú)菌純水的離心管中制成濃菌懸液，100℃煮沸10min，12 000r／min離心5min，取上清作為模板，并保存于-20℃?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix（含有2×TaqDNA 聚合酶，2×PCR buffer 和 2×dNTP）10μL，10 pmol／μL上、下游引物各0.5μL，ddH2O 10μL，模板為4μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃50s，50s，72 ℃ 60s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。取10μL產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像儀成像觀察拍照。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析 將耐藥基因的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，送由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，用DNA Star軟件對(duì)測(cè)序獲得的耐藥基因序列與GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 致病性E.coli分離株的耐藥性

108株雞源致病E.coli分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從表2可以看出，7種β-內(nèi)酰胺類藥物中，致病性E.coli對(duì)頭孢噻吩的耐藥率最高（95.7%），對(duì)頭孢他啶的耐藥率最低（18.5%），其余的耐藥率均超過(guò)70%?？偟膩?lái)看，致病性E.coli對(duì)頭孢菌素類藥物的耐藥率均較高。

表2 分離的致病性E.coli的耐藥情況Table 2 Antimicrobial resistance of pathogenic Escherichia coli isolated from chickens

2.2 致病性E.coli分離株耐藥基因的PCR檢測(cè)

采用PCR技術(shù)，對(duì)108株雞源致病性E.coli分離株進(jìn)行了3種β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的擴(kuò)增檢測(cè)，tem和ctx-m2種耐藥基因被檢出，獲得與預(yù)期目的片段大小相符的擴(kuò)增條帶（圖1，圖2），檢出率分別為98.1%和74.1%，未檢測(cè)到shv基因

2.3 致病性E.coli耐藥表型與耐藥基因檢出情況比較

耐藥基因在雞源致病性E.coli耐藥菌株中的檢出情況見表3。從表3可以看出，耐藥基因tem在頭孢他啶和頭孢呋肟耐藥菌株中檢出率最高，達(dá)100%，除了在頭孢曲松耐藥菌株中為79.6%外，其余的檢出率都超過(guò)了95%，與菌株耐藥性有顯著相關(guān)性（P＜0.05）；耐藥基因ctx-m在頭孢噻吩耐藥菌株中檢出率最高達(dá)86.3%，最低的是在頭孢他啶耐藥菌株也達(dá)到了50%，與菌株耐藥性有顯著相關(guān)性（P＜0.05）；tem＋ctx-m兩種耐藥基因的檢出率除了在頭孢他啶耐藥菌株中與ctx-m的一樣外，其余的都比ctx-m的檢出率略低。耐藥基因shv的檢出率為0。

圖1 tem陽(yáng)性菌株P(guān)CR產(chǎn)物擴(kuò)增圖Fig.1 PCR products of tem positive isolates

圖2 ctx-m陽(yáng)性菌株P(guān)CR產(chǎn)物擴(kuò)增圖Fig.2 PCR products of ctx-m positive isolates

表3 致病性E.coli耐藥株耐藥基因的檢出率Table 3 Detection rates of resistance genes in resistant isolates of pathogenic Escherichia coli

2.4 耐藥基因測(cè)序分析

檢出的2種β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的特異性目的條帶，經(jīng)回收測(cè)序后，分別與GenBank中的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性菌株攜帶的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因與GenBank中提供的相應(yīng)基因序列相似性均高達(dá)98%以上，其中tem基因?yàn)?9.3%，ctx-m為98.6%。

3 討 論

β-內(nèi)酰胺類藥物是醫(yī)學(xué)臨床上應(yīng)用最為廣泛的抗菌藥物之一，在獸醫(yī)臨床上也發(fā)揮著及其重要的作用，隨著該類藥物的大量使用，耐藥性問(wèn)題也越來(lái)越突出，嚴(yán)重影響了該藥物的臨床療效，已成為國(guó)內(nèi)外耐壓性研究關(guān)注的焦點(diǎn)。目前在許多國(guó)家和地區(qū)有大量關(guān)于E.coli耐藥性的研究［6-7］，E.coli的耐藥性已經(jīng)成為全球性問(wèn)題。目前，在已發(fā)現(xiàn)的ESBLs基因型中，tem有168種，shv有114種，ctx-m有89種［8］。tem已是ESBLs中最常見的基因型廣譜抗生素，特別是第三代頭孢菌素在臨床上的廣泛使用以來(lái)，使得質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)ESBLs細(xì)菌在中國(guó)不同地區(qū)廣泛傳播［9］。本文PCR結(jié)果顯示陜西部分地區(qū)tem基因檢出率最高。

張利勃等［10］研究發(fā)現(xiàn)，遼寧省ESBLs雞源E.coli基因亞型以tem為主，其次為ctx-m型，未發(fā)現(xiàn)shv型基因，與本研究結(jié)果一致。

國(guó)內(nèi)外對(duì)E.coli中質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因已有報(bào)道，但是種類單一，對(duì)于雞源致病性E.coli耐藥基因的全面研究和報(bào)道相對(duì)較少。Meunier D等［11］對(duì)法國(guó)E.coli分離株進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶基因研究，發(fā)現(xiàn)blaTEM和blaCTX-M的檢出率分別為62.5%和100%。

Li L等［12］研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)雞源E.coli中β-內(nèi)酰胺酶基因blaTEM和blaSHV在1970年-2003年檢出率有所下降，2004年-2007年又逐漸上升。Tang X等［13］對(duì)我國(guó)2004年-2007年豬源致病性E.coli耐藥基因檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因以blaTEM為主，檢出率為87%；楊澍等［14］對(duì)人源E.coliβ-內(nèi)酰胺酶耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，耐藥基因以blaTEM為主，本研究結(jié)果與其基本一致，這可能與耐藥基因在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移有關(guān)。Jacob S等［15］報(bào)道，ESBLs菌可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式使耐藥菌基因在細(xì)菌間快速傳播擴(kuò)散，給臨床治療帶來(lái)困難，進(jìn)一步說(shuō)明加強(qiáng)β-內(nèi)酰胺酶監(jiān)測(cè)的迫切性和必要性。本研究結(jié)果為β-內(nèi)酰胺類抗生素的合理使用和耐藥機(jī)制的研究提供了數(shù)據(jù)支持。

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