袁焰平，任鈺為，江一波，賈啟濤，徐亞杰，肖 犟，方 瑞，李其安，趙俊龍，張淑君＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070；2.襄樊正大農(nóng)牧食品有限公司，湖北襄樊441000）

豬繁殖與呼吸綜合征 （Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又名“豬藍(lán)耳病”，是20世紀(jì)80年代末發(fā)生的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種新的病毒性性傳染病 ，主要引起母豬流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙，引發(fā)新生仔豬的高致死率及生長(zhǎng)豬的呼吸道癥狀。由于該病具有抗體依賴性增強(qiáng)，免疫抑制，較強(qiáng)基因變異及能在豬體內(nèi)持續(xù)感染等生物學(xué)特性，所以很難從根本上控制該病的蔓延，使許多養(yǎng)豬企業(yè)和養(yǎng)豬戶常常陷入很無奈的境地。然而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，許多基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有抗病或者抗逆的功能以及大量分子標(biāo)記被發(fā)掘，從而使得抗病育種成為可能。

甘露聚糖結(jié)合凝集素（mannan-binding lectin）是由肝細(xì)胞合成并分泌的血清蛋白，研究表明，它能夠特異性與細(xì)菌、病毒表面的糖基結(jié)合，并通過MBL（mannan-binding lectin）途徑激活補(bǔ)體從而啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫機(jī)制，還具有介導(dǎo)吞噬和免疫調(diào)節(jié)等作用［1］。在有關(guān)人疾病的報(bào)道中，一些學(xué)者認(rèn)為MBL基因突變可能直接或者間接導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生［2］，并已經(jīng)將MBL-C基因的某些單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為幾種疾病的單倍型標(biāo)記［3-5］。豬的MBL-C基因位于第14號(hào)染色體，是MBL基因家族中的一員，它能夠在豬的多種組織器官表達(dá)。Lillie B N等［6］推斷并驗(yàn)證了豬MBL-C基因啟動(dòng)子的3個(gè)SNP突變可能增加了好幾種常見傳染病的發(fā)病幾率。

絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶1（dual specificity phosphatase 1，DUSP1）屬于一個(gè)含有超過10種酶的家族，它們能使目的蛋白中磷酸蘇氨酸、磷酸絡(luò)氨酸和磷酸絲氨酸脫磷酸化，從而使絲裂原活化蛋白激酶（activated protein kinase，MAPK）失活，起到細(xì)胞信號(hào)調(diào)控的作用［7］，DUSP1的優(yōu)先底物為p38α、-βMAPK以及c-jun氨基端激酶等是在炎癥應(yīng)答過程中起重要作用的物質(zhì)［8］，對(duì)細(xì)菌及病毒有一定的抵抗作用。

本實(shí)驗(yàn)室利用基因芯片篩選出了一批可能具有豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗性的SNP位點(diǎn)，基于以上2個(gè)基因的抗病作用機(jī)理，分別選取MBL-C基因外顯子6第296位點(diǎn)A／G突變及DUSP1基因外顯子4第308位點(diǎn)C／T突變，利用等位基因特異性PCR（AS-PCR）技術(shù)，進(jìn)行多態(tài)性及豬繁殖與呼吸綜合征抗病相關(guān)性分析，為以后的豬繁殖與呼吸綜合征抗病育種提供理論基礎(chǔ)及支持。

1 材料與方法

1.1 材料

在安徽某豬場(chǎng)采集98頭大約克母豬的尾組織，健康組和豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)病組分別為49頭，加酒精運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置-20℃保存；在湖北某豬場(chǎng)頸靜脈采集166頭長(zhǎng)大母豬的血液，健康組和豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)病組分別為71頭和95頭，加抗凝劑運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置-20℃保存。采樣的同時(shí)統(tǒng)計(jì)這些豬的健康狀態(tài)，以及發(fā)病階段的產(chǎn)仔數(shù)據(jù)等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及AS-PCR反應(yīng)條件尾組織及血液DNA的提取分別參照Chen H等［9］和張德華等［10］方法。根據(jù) MBL-C基因（GenBank：ENSSSCG00000010427）和DUSP1基因（GenBank：ENSSSCG00000016991）的序列，每個(gè)基因分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物序列、退火溫度及所擴(kuò)增目的片段大小如表1所示。表中粗斜體字母是人為引入堿基，分別與野生基因型和突變基因型相配對(duì)。

20μL PCR反應(yīng)體系包含：雙蒸水15.3μL，10×buffer（含 Mg2＋）2.0μL，5.0mmol／L dNTPs 0.6 μL，10μmol／L上下游引物各0.4μL，TaqDNA聚合酶0.3μL，DNA模板1.0μL。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；35個(gè)循環(huán)（94℃30s，72℃45s）；72℃延伸10min；16℃保存5min，其中各引物退火溫度見表1。產(chǎn)物在15g／L瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 利用SAS（9.1）軟件的對(duì)數(shù)回歸模型（logistic regression models）［11］分析各基因型發(fā)病的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。在95%的置信區(qū)間內(nèi)以其中一種純合子基因型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率為參照（reference），即odds ratio（OR）值為1.0，經(jīng)過該模型分析后，對(duì)于另外兩種基因型，如果OR值大于1.0，則該基因型具有較大的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（其風(fēng)險(xiǎn)倍數(shù)即為OR值），反之亦然；利用該軟件的方差分析程序（ANOVA tests）分析各基因型母豬產(chǎn)死仔率（含木乃伊、死胎）的差異性，數(shù)據(jù)表示方法為：平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±sD）。

表1 MBL-C基因與DUSP1基因引物序列、退火溫度及產(chǎn)物片段長(zhǎng)度Table 1 The primer sequences，Tm and product sizes of MBL-C gene and DUSP1gene

2 結(jié)果

2.1 MBL-C基因與DUSP1基因AS-PCR擴(kuò)增、基因型分型

2.1.1 MBL-C基因基因分型 對(duì)于同一樣本，分別用2對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，只有第1對(duì)引物擴(kuò)增出結(jié)果的為AA基因型，只有第2對(duì)引物擴(kuò)增出結(jié)果的為GG基因型，2對(duì)引物均能擴(kuò)增出結(jié)果的為AG基因型（圖1），圖片中上半部分為第1對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果，下半部分為第2對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果。

2.1.2 DUSP1基因基因分型 對(duì)于同一樣本，分別用兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，只有第1對(duì)引物擴(kuò)增出結(jié)果的為TT基因型，只有第2對(duì)引物擴(kuò)增出結(jié)果的為CC基因型，2對(duì)引物均能擴(kuò)增出結(jié)果的為TC基因型（圖2），圖片中上半部分為第1對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果，下半部分為第2對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 2個(gè)基因突變點(diǎn)的測(cè)序圖

2.2.1 DUSP1基因突變點(diǎn)測(cè)序 利用表1中引物，隨機(jī)抽取12個(gè)樣本按照對(duì)應(yīng)的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物混合后直接送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序（圖3和圖4）。從圖4可以看出在第155堿基處存在一個(gè)雙峰，即該處為T-C突變。

2.2.2 MBL-C基因突變點(diǎn)測(cè)序 利用表1中引物，隨機(jī)抽取12個(gè)樣本按照對(duì)應(yīng)的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物混合后直接送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，PCR產(chǎn)物圖和測(cè)序圖分別見圖5和圖6。

圖1 MBL-C基因AS-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of MBL-C gene by AS-PCR

圖2 DUSP1基因AS-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The results of DUSP1gene by AS-PCR

圖3 DUSP1基因測(cè)序用PCR產(chǎn)物圖Fig.3 PCR products of DUSP1gene for sequencing

圖4 DUSP1-EXON4-C308T突變點(diǎn)測(cè)序圖Fig.4 SNP of DUSP1-EXON4-C308T

圖5 MBL-C基因測(cè)序用PCR產(chǎn)物圖Fig.5 PCR productsof MBL-C gene for sequencing

圖6 MBL-C-EXON6-A295G突變點(diǎn)測(cè)序圖Fig.6 SNP of MBL-C-EXON6-A295G

從圖6可以看出，在第94堿基處存在一個(gè)雙峰，即該處為A-G突變。

2.3 2個(gè)基因的突變位點(diǎn)分別在大約克和長(zhǎng)大群體中的基因型頻率和等位基因頻率

從表2可以看出，將MBL-C外顯子6第296位點(diǎn)突變進(jìn)行等位基因頻率統(tǒng)計(jì)表明，在大約克群體的健康組中，G等位基因占優(yōu)勢(shì)，達(dá)到0.69，而發(fā)病組中A等位基因和G等位基因的頻率沒有太大差異，分別為0.43、0.57；在長(zhǎng)大群體中，無論是健康組還是發(fā)病組，G等位基因都是優(yōu)勢(shì)基因，其頻率分別達(dá)到0.75、0.66。利用SAS軟件的對(duì)數(shù)回歸模型計(jì)算得到：在大約克群體中，AG基因型發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率只有 GG基因的0.37倍（OR=0.37，P=0.039），差異達(dá)到顯著水平，而AA基因型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率與GG基因型發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率的差異性沒有達(dá)到顯著水平（P=0.14）；而在長(zhǎng)大群體中，AA基因型發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率只有GG基因型的0.11倍（OR=0.11，P=0.04），而AG基因型發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率與GG基因型相比，沒有達(dá)到顯著水平（P=0.91）。

從表3可以看出，在兩個(gè)群體中，無論是發(fā)病組還是健康組，T等位基因均為優(yōu)勢(shì)基因。利用SAS軟件對(duì)數(shù)回歸模型計(jì)算認(rèn)為：在大約克和長(zhǎng)大這兩個(gè)群體中，各基因型發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率的差異均沒有達(dá)到顯著水平。

表2 MBL-C基因SNP分別在大約克和長(zhǎng)大群體中的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 The frequencies of genotypes and alleles of the SNP in MBL-C gene in Yorkshire and Landrace×Yorkshire populations respectively

表3 DUSP1基因SNP分別在大約克和長(zhǎng)大群體中的基因型頻率和等位基因頻率Table 3 The frequencies of genotypes and alleles of the SNP in DUSP1gene in Yorkshire and Landrace×Yorkshire populations respectively

2.4 2個(gè)基因突變點(diǎn)各基因型分別在兩個(gè)群體中產(chǎn)死仔率的差異性比較

從表4可以看出，MBL-C基因外顯子6第296位點(diǎn)突變的各基因型母豬在兩個(gè)群體中的產(chǎn)死仔率差異沒有達(dá)到顯著水平，但是在長(zhǎng)大群體中，AA基因型母豬的產(chǎn)死仔率（0.14）低于AG基因型（0.44）和GG基因型的（0.44）；同樣DUSP1基因外顯子4第308位點(diǎn)突變的各基因型母豬在兩個(gè)群體中的產(chǎn)死仔率差異沒有達(dá)到顯著水平，然而在大約克群體中CC基因型母豬的產(chǎn)死仔率（0.27）低于TT基因型（0.51）和 TC基因型的（0.53）。

表4 兩個(gè)基因突變點(diǎn)各基因型分別在兩個(gè)群體中產(chǎn)死仔率的差異性比較Table 4 The comparison for the motality of new-born piglets among three genotypes in two SNPs in Yorkshire and Landrace×Yorkshire populations respectively

3 討論

AS-PCR技術(shù)雖然有節(jié)約成本、方便快捷等特點(diǎn)，但一個(gè)較大的缺點(diǎn)就是容易造成假陰性和假陽性，使結(jié)果不太準(zhǔn)確。保持3′端與模板嚴(yán)格配對(duì)是提高特異性的有效手段，故在引物3′端引入錯(cuò)配堿基是最常用的方法，但是該方法能夠降低引物有效延伸從而使擴(kuò)增效率降低，王瑞恒等認(rèn)為在3′端第3位或者第4位引入錯(cuò)配堿基能得到較好的擴(kuò)增效果［14］。所以，本試驗(yàn)也采取了在引物3′端引入錯(cuò)配堿基的方法以提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

MBL-C基因能夠在豬的多種組織器官中表達(dá)，其中以肝臟表達(dá)量最高，其次是腎臟、小腸和胸腺等器官。有報(bào)道稱該基因的啟動(dòng)子區(qū)第1 081位點(diǎn)GA突變?cè)诙喾N歐洲品種豬中能夠影響該基因在肝臟中表達(dá)，并且其多態(tài)性與豬繁殖與呼吸綜合征、肺炎、腸道等疾病有一定的關(guān)聯(lián)性［15-16］。MBL-C基因外顯子6第296位點(diǎn)屬于同義突變，盡管Phatsara C等［17］研究表明，該位點(diǎn)各基因型間AH50、CH50、C3c等經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)及替代補(bǔ)體系統(tǒng)中關(guān)鍵物質(zhì)的血清濃度并沒有出現(xiàn)顯著性的差異。然而我們的研究結(jié)果表明在大約克群體中AG基因型具有較小的發(fā)病幾率；在長(zhǎng)大群體中AA基因型具有較小的發(fā)病幾率，并且在該群體中AA基因型的產(chǎn)死仔率要明顯低于AG基因型和GG基因型，所以，我們推測(cè)，A等位基因可能為具有抗豬繁殖與呼吸綜合征效應(yīng)的基因。

DUSP1是核磷酸酶，它能夠在多種類型細(xì)胞及組織中廣泛表達(dá)，且其表達(dá)量受細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞活素類及脂多糖等物理和化學(xué)因素的影響。人們發(fā)現(xiàn)來自DUSP1基因缺失小鼠的巨噬細(xì)胞經(jīng)脂多糖處理后，P38活化作用能明顯增強(qiáng)和延長(zhǎng)，且與野生型小鼠相比，DUSP1基因缺失小鼠脂多糖誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)要強(qiáng)烈許多［18-21］。DUSP1還能影響巨噬細(xì)胞中TNF、IL-6和COX2等炎癥基因的表達(dá)以及角叉藻聚糖誘導(dǎo)的水腫反應(yīng)，被認(rèn)為是通過限制P38 MAPK來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)重炎癥應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白［22］。雖然該基因被證實(shí)與疾病的發(fā)生及抵抗有關(guān)系，在之前本小組的基因芯片結(jié)果中，其外顯子第308位點(diǎn)突變各基因型頻率在健康豬及豬繁殖與呼吸綜合征患豬中呈現(xiàn)出顯著差異性，但是在本試驗(yàn)中卻未能得到一致的結(jié)果，因此不能確定該位點(diǎn)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征有抵抗作用。

因此，通過本試驗(yàn)，可以認(rèn)為MBL-C基因外顯子6第296位點(diǎn)的A等位基因?qū)ωi繁殖與呼吸綜合征病毒有一定的抵抗作用，在豬群中可以通過人工選擇提高A等位基因的頻率，達(dá)到提高豬群對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒有抗性能力的目的。

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