許宗麗，謝芝勛，謝麗基，劉加波，鄧顯文，謝志勤，龐耀珊，范 晴，羅思思

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

鴨新城疫（Duck Newcastle disease）是由鴨源新城疫病毒（Duck Newcastle disease virus，DuNDV）引起的以消化道病變?yōu)橹饕卣鳌⒕哂懈叨劝l(fā)病率和致死率的烈性傳染病。鴨群中流行的新城疫會(huì)給養(yǎng)鴨業(yè)造成較大損失［1］，同時(shí)也嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的安全。鴨瘟（Duck plague，DP）是由鴨瘟病毒（DPV）引起的一種急性、高度接觸性傳染?。?］。鴨瘟流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和病死率都很高，是危害養(yǎng)鴨業(yè)較為嚴(yán)重的傳染?。?］。鴨新城疫和鴨瘟都有相同的臨床癥狀，精神沉郁，兩腿無(wú)力，呼吸困難，角弓反張，下?。?-5］，在臨床上較難做出診斷。鴨圓環(huán)病毒?。―uck circovirus disease）是由鴨圓環(huán)病毒（DuCV）引起的一種主要侵害免疫系統(tǒng)的病毒?。?］，致免疫功能的下降或免疫抑制的疾?。?］。圓環(huán)病毒感染的鴨群機(jī)體免疫力受抑制，造成鴨群與其他病原菌或病毒的混合感染情形非常復(fù)雜［8-9］?？梢?jiàn)，這三種傳染病嚴(yán)重地影響著養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。因此，建立同時(shí)快速鑒別檢測(cè)鴨源新城疫病毒、鴨瘟病毒和鴨圓環(huán)病毒的方法對(duì)這三種傳染病的防控有著重要的意義。

目前對(duì)于病毒性疫病的診斷一般采用病原分離鑒定和血清學(xué)方法，但這些方法存在操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力敏感性較差等缺點(diǎn)，特別是當(dāng)鴨群混合感染多種病原時(shí)，應(yīng)用常規(guī)方法難以進(jìn)行早期快速檢測(cè)和鑒別診斷。多重PCR是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的，即在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目的基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的方法，具有可同時(shí)檢測(cè)、鑒別多種病原體的突出特點(diǎn)，在臨床多種病原混合感染的鑒別診斷上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和很高的實(shí)用價(jià)值［10-11］。本研究設(shè)計(jì)了3對(duì)特異引物，建立了鴨源新城疫病毒、鴨瘟病毒和鴨圓環(huán)病毒的三重PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 2×Taq PCR Mix購(gòu)自北京天根生物技術(shù)公司；TIANamp血液／細(xì)胞／組織 基因DNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司；RNA提取試劑TRIzol LS Reagent購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2 病毒株 鴨瘟病毒（DPV）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鴨源新城疫病毒（DuNDV）、鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、番鴨細(xì)小病毒（MDPV）、鴨源小鵝瘟病毒（鴨源GPV）、番鴨呼腸病毒、鴨源H9亞型流感病毒、H5亞型流感病毒核酸、鴨疫里默桿菌、大腸埃希菌（E.coli）、禽多殺性巴氏桿菌等由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和合成 從GenBank中下載鴨源新城疫病毒、鴨瘟病毒和鴨圓環(huán)病毒的基因序列，利用Lasergene軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，在保守區(qū)運(yùn)用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 研究用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.2.2 核酸的提取 參照TIANamp血液／細(xì)胞／組織 基因DNA提取試劑盒說(shuō)書(shū)，提取DuCV、MDPV、DPV、鴨源GPV、鴨疫里默桿菌、E.coli、禽多殺性巴氏桿菌的DNA；參照Trizol LS Reagent使用說(shuō)明書(shū)抽提DuNDV、番鴨呼腸病毒、鴨源H9亞型流感病毒的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 三重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化：對(duì)DuNDV引物、DPV引物、DuCV引物、模板等用量進(jìn)行優(yōu)化，多次重復(fù)試驗(yàn)后確定最佳反應(yīng)用量。將溫度按50℃～65℃依次遞增，多次重復(fù)試驗(yàn)后確定最佳退火溫度。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。

1.2.4 三重PCR的特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化好的三重PCR反應(yīng)體系，以 DuNDV、DPV、DuCV、MDPV、番鴨呼腸病毒、鴨源GPV、H5亞型流感、鴨源H9亞型流感病毒、鴨疫里默桿菌、E.coli、禽多殺性巴氏桿菌的核酸為待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)三重PCR方法的特異性。

1.2.5 三重PCR的靈敏性試驗(yàn) 使用Beckman UV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)定DuNDV、DPV和DuCV的核酸濃度，并按10倍遞增稀釋。從第二稀釋度開(kāi)始進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，評(píng)估該三重PCR檢測(cè)方法的敏感性。

1.2.6 三重PCR的應(yīng)用 應(yīng)用建立的三重PCR方法對(duì)廣西地區(qū)送檢的180份病料進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 三重PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建和優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)對(duì)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定三重PCR反應(yīng)體系為25μL：2×TaqPCR Mix 12.5μL，引物DuCV140、DuCV477、 DPV47、 DPV622 （50 μmol／mL）各 0.2 μL，引 物 DuNDV424、DuNDV1247（50μmol／mL）各0.3μL，模板各1 μL，加水至25μL。反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化（圖1），確定最佳的反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min，55℃0.45min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min（圖2）。

圖1 三重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimized results of the annealing temperature for triplex PCR

圖2 三重PCR的最佳反應(yīng)結(jié)果Fig.2 The results of optimal reaction for the triplex PCR

2.2 三重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，從DuNDV擴(kuò)增出823 bp的特異性條帶，DPV擴(kuò)增出576bp的特異性條帶，DuCV擴(kuò)增出338bp的特異性條帶；而其他病原均未擴(kuò)增出特異條帶（圖3）。

圖3 三重PCR特異性試驗(yàn)Fig.3 The specificity test of the triplex PCR

2.3 三重PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

用DU 800紫外分光光度計(jì)測(cè)得DuNDV、DPV、DuCV核酸濃度分別為2.59×107、1.12×107、4.67×106拷貝／μL，并按10倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋。從第2個(gè)稀釋梯度開(kāi)始應(yīng)用建立的三重PCR方法進(jìn)行核酸模板檢測(cè)，結(jié)果顯示，建立的三重PCR方法對(duì)DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低檢出限分別為2.59×103、1.12×103、4.67×102拷貝／μL（圖4）。

2.4 三重PCR的臨床應(yīng)用

對(duì)廣西地區(qū)的180份病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出10份鴨圓環(huán)病毒，陽(yáng)性率為5.6%；檢出1份鴨源新城疫病毒，陽(yáng)性率為0.56%；未檢出鴨瘟病毒；無(wú)混合感染。

3 討論

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。能在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)出多種病原或?qū)τ卸嗷蛐偷牟≡M(jìn)行分型［12-13］；適用于成組病原體的檢測(cè)，如腸道致病性細(xì)菌和病毒等；經(jīng)濟(jì)便捷，多種病原在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，大大縮短檢測(cè)時(shí)間，節(jié)約試劑和經(jīng)費(fèi)，為臨床提供更多診斷信息。但由于一個(gè)體系中有多種引物和模板，容易相互干擾而引起非特異擴(kuò)增。因此，引物特異、各引物濃度適宜、各引物退火條件相近以及合適大小梯度的目的片段是建立多重PCR的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究設(shè)計(jì)了一套特異性的引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系，建立了一個(gè)反應(yīng)管能同時(shí)檢測(cè)鴨源新城疫病毒、鴨瘟病毒和鴨圓環(huán)病毒的多重PCR檢測(cè)方法。

目前，由于DuCV尚沒(méi)有一個(gè)合適的體外培養(yǎng)方法，鴨圓環(huán)病毒病的診斷往往借助于分子生物學(xué)方法如PCR，熒光定量PCR等［14］。鴨圓環(huán)病毒感染導(dǎo)致鴨免疫力下降而容易感染其他病毒。劉少寧等［15］對(duì)我國(guó)山東省742只櫻桃谷鴨（Cherry Valley ducks）中DuCV及混合感染的情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，單純感染DuCV的樣品只占被調(diào)查樣品總數(shù)的18.10%，15.19%為DuCV和其他病原的混合感染。張坤等［16］曾報(bào)道山東省濰坊市某鴨場(chǎng)暴發(fā)鴨瘟與鴨源新城疫病毒的混合感染。鴨瘟和鴨新城疫都是烈性傳染病，一旦暴發(fā)兩者混合感染的疫情，就會(huì)給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成重大損失。本研究建立的PCR方法快速準(zhǔn)確，適于鴨圓環(huán)病毒、鴨源新城疫病毒與鴨瘟病毒的混合感染檢測(cè)，為鴨圓環(huán)病毒病、鴨瘟和鴨新城疫等重大動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)提供可靠的技術(shù)服務(wù)。

用本研究建立的三重PCR方法對(duì)廣西地區(qū)180份病料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出鴨圓環(huán)病毒的感染率為5.6%，表明廣西地區(qū)存在鴨圓環(huán)病毒的感染；檢出鴨源新城疫病毒的感染率為0.56%；未檢出鴨瘟病毒，可能該種病毒在該地區(qū)已得到較好的防控，同時(shí)也提示需要進(jìn)行更多的臨床樣品的檢測(cè)。

［1］ 張 存，葉偉成，劉蔓雯，等.鵝與番鴨潰瘍性胃腸炎病原的分離鑒定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2002，34（2）：27-28.

［2］ Sandhu T S，Shawky S A.Duck virus enteritis（duck plague）［C］／／Saif Y M，Barnes H J，Glisson J R，et al.Diseases of Poultry.11th ed.Ames：Iowa State University Press，2003：354-363.

［3］ 卡爾尼克BW.禽病學(xué)［M］.10版.高 福.蘇敬良，譯：北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999：857-867.

［4］ 殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.北京：北京科學(xué)出版社，1997：67-78，1073-1079.

［5］ 賈榮澤，張 璇，亓麗紅.常見(jiàn)肉鴨病毒性傳染病的診治［J］.水禽世界，2007（1）：23-24.

［6］ 蔡寶祥.圓環(huán)病毒與禽鳥(niǎo)免疫抑制［J］.中國(guó)家禽，2001，23（19）：6-9.

［7］ Soike D K，Albrecht K，Hattermann C，et al.Novel circovirus inmulard ducks with developmental and feathering disorders［J］.Vet Rec，2004，154：792-793.

［8］ Chen C，Wang P，Lee M，et al.Development of a polymerase chain reaction procedure for detection and differentiation of duck and goose circovirus［J］.Avian Dis，2006，50：92-95.

［9］ 柴同杰.山東省櫻桃谷鴨群鴨圓環(huán)病毒及混合感染的調(diào)查［J］.中國(guó)家禽，2009，31（6）：4-7.

［10］ Elnifro E，Ashshi A，Cooper R，et al.Multiplex PCR：Optimization and application in diagnostic virology［J］.Clin Microbiol Rev，2000，13（4）：559.

［11］ 謝芝勛，龐耀珊，鄧顯文，等.多重RT-PCR同時(shí)鑒別三種對(duì)蝦病毒的研究與應(yīng)用［J］.病毒學(xué)報(bào)，2005，21（5）：393-396.

［12］ 謝芝勛，謝志勤，龐耀珊，等.應(yīng)用三重聚合酶鏈反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)鑒別雞新城疫、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒和雞毒支原體的研究［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，12（6）：443-446.

［13］ Xie Z，Pang Y S，Liu J，et al.A multiples RT-PCR for type A influenza virus and di fferentiation of avian H5，H7and H9 hemagglutinin subtypes［J］.Mol Cell Probes，2006，20（3-4）：245-249.

［14］ Fringuelli E，Scott A N J，Beckett A，et al.Diagnosis of duck circovirus infections by conventional and real time polymerase chain reaction tests［J］.Avian Pathol，2005，34：495-500.

［15］ 劉少寧，張興曉，陳 智，等.我國(guó)自然發(fā)病鴨群中鴨圓環(huán)病毒的流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29（11）：1402-1405.

［16］ 張 坤，刁有祥，陳 琳.鴨瘟與鴨副黏病毒混合感染種鴨的診治［J］.中國(guó)家禽，2011，33（22）：56-57.