范 晴，謝芝勛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝志勤，謝麗基，羅思思

（廣西獸醫(yī)研究所 廣西動(dòng)物疫苗和新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）可引起的牛的致死性腹瀉，呼吸障礙及繁殖失敗。懷孕母牛感染BVDV后，可引起死產(chǎn)、流產(chǎn)以及胚胎畸形，或是分娩出表面看似正常的持續(xù)感染的犢牛。這種持續(xù)感染的犢牛雖不表現(xiàn)任何臨床癥狀，但可終身帶毒，持續(xù)排毒，成為重要傳染源，而且一旦當(dāng)再次接觸BVDV相似性抗原立刻繼發(fā)為黏膜病，表現(xiàn)為急性脫水性腹瀉，病死率高達(dá)100%，給養(yǎng)牛業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。

BVDV屬于黃病毒科瘟病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約12.5kb，僅含有一個(gè)能編碼約4 000個(gè)氨基酸多聚蛋白大的ORF，ORF兩側(cè)的各有一個(gè)非編碼區(qū)（UTR）。多聚蛋白經(jīng)翻譯和加工后，可形成11種成熟的蛋白，其基因在基因組上相對(duì) 的 順 序 為：5′-p20-pl4-gp48-gp25 （E1）-gp53（E2）-p125（NS2-3）-cp54／p80（NS3）-p10（NS4A）-p30（NS4B）-p58（NS5A）-p75（NS5B）-3′，其中C、Ems、E1、E2是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白［3］。囊膜糖蛋白 E2由gp53編碼，位于BVDV囊膜表面，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)，參與宿主細(xì)胞識(shí)別、吸附過(guò)程，因此作為診斷抗原具有良好的前景。E2蛋白由374個(gè)氨基酸殘基組成，位于ORF的2 077位～3 198位，蛋白分子質(zhì)量約為42ku。E2蛋白保守性低，在各個(gè)毒株中變異較大，分為2個(gè)可變區(qū)（V1和V2）。氨基酸序列分析證實(shí)，糖蛋白E2區(qū)存在著2個(gè)高可變結(jié)構(gòu)域，疏水性分析證實(shí)這2兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是親水的，表明它們位于病毒粒子的外表面，是病毒引起免疫應(yīng)答產(chǎn)生的保護(hù)性抗的重要原決定簇，參與病毒的感染過(guò)程［4］。由于BVDV僅有一種血清型，因此本研究將在昆蟲細(xì)胞上表達(dá)BVDV E2基因，并將獲得天然蛋白折疊特性的BVDV E2囊膜蛋白制備出具有良好反應(yīng)原性的抗原，為BVDV抗體檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、載體、血清 BVDV分離株NADL凍干毒及BVDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；MDBK細(xì)胞購(gòu)自武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，凍干毒參照文獻(xiàn)［5］傳代增殖；大腸埃希菌Top10，pFastBacHTA質(zhì)粒和DH10BAC菌株，為云南出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstⅠ、DNA Marker、T4連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axy-GEN公司；胎牛血清、Grace’s細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自GBICO公司；兔抗牛IgG-HRP抗體購(gòu)自KPL公司；Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 BVDV NADL毒株參照文獻(xiàn)在MDBK細(xì)胞上增殖，72h收獲病毒，反復(fù)凍融3次后，離心后取上清，參照Invitrogen公司Trizol說(shuō)明書抽提病毒RNA。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中的BVDV NADL基因序列（GenBank登錄號(hào)：M31182.1），用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增E2基因的引物，下劃線序列分別為BamHⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)：E2上游引物：5′-TTTGGATCCGATGGTACAGGGCATTCT-3′，E2下游引物：5′-TTCTGCAGCCACCTCCAGGTCAAACCAGT-3′。擴(kuò)增片段大小為1 044bp。通用引物（M13）參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使用手冊(cè)進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.3 pFastBacHTA-E2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用設(shè)計(jì)的特異性引物（E2上／E2下）對(duì)BVDV cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性5min；94℃30s，52℃35s，72℃40s，共35個(gè)循環(huán)；72℃7min 10℃。反應(yīng)結(jié)束后，用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物回收后用BamHⅠ和PstⅠ進(jìn)行雙酶切，回收E2基因片斷，連接入pFast-BacHTA，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Top10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.4 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 將pFast-BacHTA-E2陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體，通過(guò)四環(huán)素、卡那霉素和慶大霉素篩選重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-E2，提取桿粒分別用M13載體引物和E2引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.5 重組桿粒在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá) 參照Invitrogen Bac-to-Bac Baculovirus Expression System使用說(shuō)明手冊(cè)進(jìn)行，將重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-E2的桿粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，設(shè)熒光蛋白轉(zhuǎn)染為對(duì)照。盲傳3代后收獲含有E2基因的重組桿狀病毒。

1.2.6 重組表達(dá)蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析 取重組病毒感染細(xì)胞裂解物上清進(jìn)行SDS-PAGE。將電泳后的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜做Western blot，一抗為BVDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（1∶1 000），二抗為兔抗牛IgG-HRP抗體（1∶3 000），同時(shí)做sf9細(xì)胞上清為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pFastBacHTA-E2的鑒定

對(duì)重組質(zhì)粒pFastBacHTA-E2進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物為1 044bp（圖1），與預(yù)期大小相符。用BamHⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物分別為1 044bp和4 805bp（圖2），均與大小預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果顯示，插入的基因含有牛病毒性腹瀉病毒E2基因的完整開放閱讀框架，且插入方向正確，表明成功構(gòu)建了昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pFastBacHTAE2。

圖1 PCR鑒定pFastBacHTA-E2Fig.1 PCR identification of pFastBacHTA-E2

圖2 pFastBacHTA-E2酶切鑒定Fig.2 Identification of pFastBacHTA-E2by enzyme digestion

2.2 轉(zhuǎn)座桿粒的PCR鑒定

pFastBacHTA-E2轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，用四環(huán)素、卡那霉素和慶大霉素篩選后，提取其DNA，用M13引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物約為4 000bp（圖3），表明已成功轉(zhuǎn)座E2基因。

圖3 重組桿粒Bacmid-E2的PCR鑒定Fig.3 Identification of the Bacmid-E2by PCR

2.3 重組表達(dá)蛋白的SDS-PAGE和Western blot

將重組病毒感染細(xì)胞裂解上清進(jìn)行SDS-PAGE，在43.6ku左右可見蛋白條帶，表明有表達(dá)產(chǎn)物，蛋白大小和預(yù)期一致（圖4）。Western blot分析，在約43.6 ku處出現(xiàn)特異性印跡，而對(duì)重組桿粒感染sf9表達(dá)上清在此位置沒(méi)有出現(xiàn)特異性印跡（圖5）。

圖4 E2重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein E2

3 討論

BVDV在我國(guó)廣泛存在，據(jù)報(bào)導(dǎo)安徽、江蘇、廣西部分地區(qū)水牛的BVDV感染率為分別為34.2%、8.4%和10%［6］。大部分情況下，BVDV存在于牛體內(nèi)，以持續(xù)性感染不發(fā)病的形式存在，成為潛在的感染源。由于BVDV發(fā)病機(jī)理及臨床特征的復(fù)雜性，用PCR、LAMP等一系列抗原檢測(cè)技術(shù)容易漏檢［7-9］，而抗BDVD抗體的檢測(cè)能有效的監(jiān)測(cè)畜群BVDV的感染狀況。目前所使用的BVDV血清學(xué)檢測(cè)方法有病毒中和試驗(yàn)，瓊擴(kuò)試驗(yàn)，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，間接免疫熒光試驗(yàn)，免疫印跡及各種ELISA。雖然目前使用最為廣泛的是病毒中和試驗(yàn)，但當(dāng)面對(duì)大規(guī)模范圍檢測(cè)時(shí)，ELISA比病毒中和試驗(yàn)更省時(shí)省力，它既然不需病毒培養(yǎng)，攻擊病毒，且?guī)讉€(gè)小時(shí)之內(nèi)即可出結(jié)果，更為經(jīng)濟(jì)，適合大規(guī)模多數(shù)量的檢測(cè)。目前，我國(guó)尚未開發(fā)出有關(guān)BVDV抗體檢測(cè)試劑盒，仍依賴于國(guó)外的試劑盒，而國(guó)外的試劑盒價(jià)格昂貴，因此選擇優(yōu)勢(shì)抗原建立診斷試劑盒具有重要意義。

圖5 E2重組蛋白Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of recombinant protein E2

E2是BVDV的囊膜蛋白，免疫原性最強(qiáng)，能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，并產(chǎn)生中和抗體，是制備檢測(cè)抗原和疫苗的首選基因，對(duì)BVDV E2表達(dá)和免疫原性的研究已經(jīng)進(jìn)行了很多。Marzocca M P等［10］將E2基因在黑腹果蠅里進(jìn)行表達(dá)，重組的E2蛋白表現(xiàn)出良好的抗原性并建立了間接ELISA方法檢測(cè)BVDV；Ferrer F等［11］將用Rachiplusia nu larvae桿狀病毒蛋白表達(dá)體系獲得E2重組蛋白，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該蛋白可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，可用于制備疫苗抗原；Deregt D等［12］制備了抗E2的單克隆抗體，也表現(xiàn)出較好的反應(yīng)原性；國(guó)內(nèi)李嬌等人也將E2在原核表達(dá)載體PET32a上進(jìn)行了表達(dá)。

本研究擴(kuò)增和克隆了BVDV E2蛋白，利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)體系，在昆蟲細(xì)胞上表達(dá)了重組E2蛋白。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)比起傳統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)具有以下的優(yōu)越性：①安全性高，特異性強(qiáng)。桿狀病毒的宿主屬于無(wú)脊椎動(dòng)物，對(duì)人畜和其他脊椎動(dòng)物沒(méi)有感染性，相對(duì)于腺病毒載體（Adenovirus vector）和慢病毒載體（Lentivector）來(lái)說(shuō)，安全性較好；②表達(dá)效率高。桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子和P10蛋白啟動(dòng)子可高效表達(dá)外源蛋白，最高表達(dá)量可達(dá)占感染細(xì)胞總蛋白量的50%，而且多角體蛋白和P10蛋白是病毒基因組內(nèi)的非必需片段，插入外源基因后不影響病毒的復(fù)制和感染；③表達(dá)的蛋白具有較好的生物學(xué)活性。相對(duì)于原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，昆蟲細(xì)胞為真核生物細(xì)胞，其對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)后修飾加工的方式與天然蛋白接近，能識(shí)別并正確地進(jìn)行信號(hào)肽的切除及磷酸化、糖基化等反應(yīng)，并且使外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成，使其在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白；④外源基因插入到多角體蛋白基因座位時(shí)，必然引起后者的缺失或滅活，因此重組病毒將不能產(chǎn)生多角體，這不僅為重組病毒提供了供選標(biāo)記，而且重組病毒不能像野生病毒一樣在環(huán)境中存在，安全性好；⑤容量大。桿狀病毒基因組大約90ku～160 ku，具有多個(gè)天然強(qiáng)啟動(dòng)子，也易于添加新的人工啟動(dòng)子，可同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因，并且可容納較大片段的外源基因。本研究所表達(dá)的E2蛋白經(jīng)Western blot鑒定，表達(dá)的蛋白能與BVDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)且表達(dá)條帶濃度高。適合于下一步大量的制備與純化蛋白，為建立BVDV ELISA檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

［1］ Kalaycioglu A T.Bovine viral diarrhoea virus（BVDV）diversity and vaccination.A review［J］.Vet Q ，2007，29（2）：60-67.

［2］ Verberne L R.BVD virus causes heavy losses in a Scottish cattle herd［J］.Vet Rec，2007，160（9）：281-4.

［3］ 殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997：645-652.

［4］ Liang R，van den Hurk J V，Zheng C，et al.Immunization with plasmid DNA encoding a truncated，secreted form of the bovine viral diarrhea virus E2protein elicits strong humoral and cellular immune responses［J］.Vaccine，2005，23（45）：5252-5262.

［5］ 王樹成，林建輝，劉 宏，等.用 MDBK傳代細(xì)胞繁殖BVD毒株的研究［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，1995，12（4）：6-8.

［6］ 邱昌慶，郭慧琛，程淑敏，等.安徽、江蘇、廣西部分地區(qū)水牛牛病毒性腹瀉／粘膜病血清學(xué)監(jiān)測(cè)［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22（6）：453-454.

［7］ 范 晴，謝芝勛，劉加波，等.牛病毒性腹瀉病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立［J］.生物技術(shù)通訊，2010，21（2）：248-251.

［8］ 范 晴，謝芝勛，劉加波，等，牛病毒性腹瀉病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，30（10）：10-14.

［9］ Fan Q，Xie Z，Xie L，et al.A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of bovine viral diarrhea virus［J］.J Virol Meth，2012，186（1-2）：43-48.

［10］ Marzocca M P，Seki C，Giambiagi S M，et al.Truncated E2 of bovine viral diarrhea virus （BVDV）expressed in Drosophila melanogaster cells：a candidate antigen for a BVDV ELISA［J］.J Virol Methods 2007，144（1-2）：49-56.

［11］ Ferrer F，Zoth S C，Calamante G，et al.Induction of virusneutralizing antibodies by immunization with Rachiplusia nuperos infected with a recombinant baculovirus expressing the E2glycoprotein of bovine viral diarrhea virus［J］.J Virol Meth，2007，146（1-2）：424-427.

［12］ Deregt D，van Rijn P A，Wiens T Y，et al.Monoclonal antibodies to the E2protein of a new genotype（type 2）of bovine viral diarrhea virus define three antigenic domains involved in neutralization［J］.Virus Res 1998，57（2）：171-181.