彭李博 綜述，王建東 審校

(本文編輯:張仲書)

促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞激酶(erythropoietin producing hepatocyte kinase，Eph)受體是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族最大的亞族，分為Eph A和Eph B受體。Eph受體及其配體Ephrin之間的信號傳遞在生物體的胚胎發(fā)育、神經(jīng)軸突導向和血管生成等方面發(fā)揮著重要作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)Eph受體及其配體在大腸癌組織中的異常表達，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、預后等密切相關。Eph及其配體Ephrin有可能成為預防和治療大腸癌的一個新靶標，本文就近年來Eph基因與結(jié)直腸癌的相關研究綜述如下。

1 Eph基因家族組成

1.1 Eph的發(fā)現(xiàn)與命名 1987年 Hirai等［1］發(fā)現(xiàn)Eph基因，在克隆出該基因全部cDNA序列后，發(fā)現(xiàn)該基因在一株產(chǎn)生紅細胞生成素的人肝癌細胞系ETL-1中呈現(xiàn)高表達，故命名該新基因為Eph基因。根據(jù)序列同源性、結(jié)構(gòu)與配體結(jié)合特性的不同，Eph受體被分為Eph A和Eph B兩個亞族，配體分Ephrin A和Ephrin B兩個亞型。其中Eph A受體包括Eph A1～10，其配體為Ephrin A1～6；Eph B受體包括Eph B1～6，其配體為Ephrin B1～3。

1.2 Eph的結(jié)構(gòu) Eph為跨膜I型糖蛋白，分為3個結(jié)構(gòu)域：糖基化的胞外區(qū)、細胞內(nèi)具有酪氨酸激酶活性的功能區(qū)(胞內(nèi)區(qū))和連接二者的由疏水氨基酸組成的跨膜區(qū)。胞外區(qū)由免疫球蛋白樣元件的配體結(jié)合域、1個半胱氨酸富含區(qū)(有20個半胱氨酸殘基)、1個N端球狀結(jié)構(gòu)域和2個纖維結(jié)合蛋白Ⅲ型同源區(qū)組成，其N端球狀結(jié)構(gòu)域決定了受體與配體結(jié)合的特性和亞族特異性；胞內(nèi)區(qū)包含近膜區(qū)、保守的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、SAM結(jié)構(gòu)域(sterile α motif，SAM)和 C端的突出后密度蛋白-大盤-密閉小帶(Post-synaptic density protein，Discs large，Zonula occludens，PDZ)結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序。近膜區(qū)、激酶結(jié)構(gòu)域、SAM結(jié)構(gòu)域包含多個酪氨酸殘基，它們的磷酸化可為包含SH2/SH3結(jié)構(gòu)域(Src-Homology-2/3)或磷酸化酪氨酸結(jié)合(phospho-tyrosine binding，PTB)結(jié)構(gòu)域的信號蛋白提供結(jié)合位點。高度保守的SAM結(jié)構(gòu)域可通過同源或異型聚物的形成來介導蛋白間相互作用，為啟動下游反應及為結(jié)合小分子量磷酸酶提供適宜的接觸部位。PDZ結(jié)合基序與包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合后可為膜上蛋白復合物的組裝提供平臺。

1.3 Ephrin的結(jié)構(gòu) Ephrin A通過糖基磷脂酰肌醇鏈錨定在細胞膜上，Ephrin B為單次跨膜蛋白，包括信號區(qū)、結(jié)合區(qū)、間隔區(qū)和疏水區(qū)。Ephrin B的羧基末端由保守的酪氨酸殘基和 PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序組成，可為包含 SH2/SH3或 PTB結(jié)構(gòu)域的信號蛋白提供停泊位點(圖1)。

圖1 Eph和Ephrin結(jié)構(gòu)模式圖

2 Eph基因的生理功能

Eph受體與其配體Ephrin之間相互作用，通過細胞信號通路介導對胚胎發(fā)育、神經(jīng)軸突導向、血管生成等方面起到了重要的作用［2］。

在維持生物體胚胎發(fā)育方面，在胚胎發(fā)育過程中Eph B2受體和Ephrin B配體系統(tǒng)對后腦的形成發(fā)揮了重要作用，Eph B2受體與鄰近細胞表面的Ephrin B配體的結(jié)合啟動雙向細胞信號通道傳遞，導致兩個細胞之間的排斥，限制了鄰近細胞群的混雜，從而調(diào)控細胞的遷徙和黏附，以維持組織和細胞正常的空間排列和形態(tài)。Batlle［3］的研究進一步肯定了這種作用，在Eph B2受體表達缺陷的小鼠腸道黏膜中，觀察到具有增殖和分化能力的各種前體細胞遷移定位導向錯亂，不能到達正確的位置，吸收細胞、杯狀細胞以及潘式細胞的前體細胞沿著隱窩―鞭毛軸混亂排列，同種細胞相互聚集。Eph B2表達缺失導致腸道黏膜細胞排列紊亂，改變了各種細胞的生存內(nèi)環(huán)境，對細胞代謝亦產(chǎn)生一定的影響。

在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)軸突導向方面，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中線結(jié)構(gòu)表達Ephrin的細胞，與其他軸突競爭投射部位，并在已穿過中線結(jié)構(gòu)的周圍有Eph的代償性表達，以避免軸突再次穿過中線。由此，軸突可以發(fā)現(xiàn)正確投射路徑，形成完整的神經(jīng)功能網(wǎng)絡［4］。利用基因敲除實驗證實，Ephrin B配體在表達軸突中傳導信號，通過Ephrin B配體與Eph B受體胞外結(jié)合域的相互作用，顯示出介導軸突生長形成大腦前連合，或者形成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突。事實上，當小鼠缺乏某一特定的Eph B基因，就出現(xiàn)軸突投射異常，但這種介導錯誤會被以表達缺乏激酶結(jié)合域但含有胞外結(jié)合域的Eph B2的修整形式所糾正。Eph B2的內(nèi)在信號傳導功能作為介導軸突并非必須，而其胞外結(jié)合域卻扮演著重要角色，推測是通過激活Ephrin B配體的信號傳導通路而發(fā)揮作用。

在控制血管生成方面，Eph受體作為受體酪氨酸激酶家族之一，與其配體結(jié)合能控制血管生成。Ephrin A1是Eph受體第一個被明確的配體，為一種被腫瘤壞死因子α誘導的基因，已從人臍靜脈內(nèi)皮細胞克隆出。在非成人組織早期器官形成的胚胎內(nèi)皮細胞中已可檢測Ephrin A1轉(zhuǎn)錄，這預示著Ephrin A1配體在血管形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮生理功能。Eph B2受體與配體Ephrin B2結(jié)合活化，在動脈形成中調(diào)控內(nèi)皮細胞和間葉細胞相互間的聯(lián)系，促進血管平滑肌細胞的增殖。Ephrin B2羧基端缺乏PDZ模序可擾亂淋巴管內(nèi)皮細胞的生長，阻止末梢毛細淋巴管床的形成，而Ephrin B2中的PDZ模序?qū)τ谘艿陌l(fā)育并不是必須的。據(jù)此推測，Ephrin B2可能是通過不同的信號機制來控制血管和淋巴管生長。

3 Eph A亞群在結(jié)直腸癌中的表達及意義

Saito等［5］運用免疫組化方法對194例原發(fā)性結(jié)直腸癌進行Eph A2的表達研究，他們發(fā)現(xiàn)Eph A2的高表達與腫瘤肝轉(zhuǎn)移、淋巴管侵襲以及臨床分期有關；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系也非常明顯。Eph A2和Ephrin A1有助于誘導腫瘤新生血管的形成，Eph A2在結(jié)直腸癌中的表達高于正常黏膜，在Ⅰ、Ⅱ期腫瘤中的表達高于Ⅲ、Ⅳ期；在直徑≤5 cm腫瘤中的表達高于直徑＞5 cm者，由此推斷Eph A主要在結(jié)直腸癌早期階段發(fā)揮重要作用。Dong等［6］研究發(fā)現(xiàn)Eph A1在腸癌細胞中表達程度不同，并存在甲基化傾向。Eph A1蛋白在腸腺瘤中呈彌漫強陽性，在癌組織中不表達或低表達；低表達多見于低分化腺癌、腸壁浸潤程度更深和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Eph A1下調(diào)多見于中晚期病例，下調(diào)較上調(diào)患者預后不良，表達越低，生存率越低，研究［7］證實，去甲基化處理可以使Eph A1重新表達。Wang等［8］檢測大腸癌細胞系中Eph A7的表達，發(fā)現(xiàn)大腸癌細胞系DLD1、HT29、HCT116、SW480和 SW620中 Eph A7基因低表達。經(jīng)甲基化特異性引物基因擴增、亞硫酸氫鈉處理后DNA測序等，發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)CpG島高甲基化。進一步應用RT-PCR技術(shù)［9］，檢測出結(jié)直腸癌患者血漿中微量游離DNA中甲基化的Eph A7基因，提示啟動子區(qū)CpG島甲基化是Eph A7在大腸癌中低表達的機制，血漿甲基化Eph A7可能作為一種新的腫瘤標志物。Xi等［10］研究發(fā)現(xiàn)Eph A3在大腸癌組織中的表達顯著高于正常黏膜，Eph A3的表達與腫瘤的大小、組織學分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期相關，Eph A3的高表達與低生存率相關。Eph A3可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，可作為腫瘤治療臨床評估和評價大腸癌預后的一個有利指標。Oshima等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Eph A2的過表達與Eph B1的低表達可能促進大腸癌的肝轉(zhuǎn)移，提示有可能成為預測大腸癌肝轉(zhuǎn)移的一個有效指標。Eph A在大腸癌發(fā)生的不同階段其表達情況不一致，Eph A的表達與大腸癌的分級與分期存在一定的相關性，但目前關于Ephrin A在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用報道較少，還有待進一步的研究［12］。

4 Eph B亞群在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用

4.1 Eph B受體的高表達 早期的研究提示多種Eph B家族的成員在人結(jié)直腸癌高表達，在癌細胞的運動、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進作用。Martiny-Baron等［13］研究發(fā)現(xiàn)Eph B4的表達在結(jié)直腸癌中明顯上調(diào)，但因研究樣本數(shù)較少(n=15)，在對比Eph B4在正常和癌組織中的表達差異時，未就Eph B4在不同腫瘤分期中的表達進行對比。

4.2 Eph B受體的低表達 新近發(fā)現(xiàn)Eph B的表達在結(jié)直腸癌中存在不同程度的下調(diào)，其表達水平與腫瘤的惡性程度和患者的生存期相關，Eph B的表達越少，腫瘤的惡性程度就越高，患者的生存期就越短。Batlle 等［14］和 Clevers等［15］檢測了 Eph B2受體在正常腸隱窩干細胞、腸腺瘤細胞、腸原位癌細胞、腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞和肝轉(zhuǎn)移細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)Eph B2受體在他們中的表達呈遞減趨勢，發(fā)現(xiàn)在小鼠結(jié)直腸癌模型中，使用基因工程技術(shù)干擾癌細胞Eph B2受體的表達，Eph B2受體的缺失加快了結(jié)直腸腫瘤的形成。這項研究提示，大多數(shù)大腸癌細胞在腺瘤和癌之間的過渡階段失去了Eph B2受體的表達，并且Eph B2表達的多少與腸癌的浸潤深度和遠端轉(zhuǎn)移密切相關，Eph B2的表達越低，腫瘤分化越差，浸潤程度越深，遠端轉(zhuǎn)移越多。這些結(jié)果在其他一些獨立實驗中也得到了進一步的支持，Guo等［16］研究認為，Eph B2在正常結(jié)腸黏膜底部腺管的上皮細胞表面、在78.0%的腺瘤、55.4%的原發(fā)性結(jié)腸癌、37.8%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織和39.2%的肝轉(zhuǎn)移組織中存在表達；結(jié)腸癌Dukes C期和D期表達低于A期和B期，中晚期結(jié)腸癌淋巴轉(zhuǎn)移灶的表達低于原發(fā)癌，肝轉(zhuǎn)移灶表達低于原發(fā)灶，在結(jié)腸癌細胞株的體外實驗中亦證明了過度表達的Eph B2受體能夠抑制腫瘤細胞的生長、黏附和轉(zhuǎn)移，推測Eph B2在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的每一個關鍵步驟中持續(xù)減少、表達缺失是預后不良的強烈指標。Merlos-Suarez等［17］發(fā)現(xiàn)成人腸道干細胞被高表達的Eph B2受體標記，被標記的干細胞在大腸癌的復發(fā)中起到了核心作用。Senior等［18］構(gòu)建的腫瘤體內(nèi)模型顯示，與對照組相比，高表達的Eph B2顯著減小腫瘤的大小達10 mm，即使是中等水平的Eph B2的表達也會減少大腸癌細胞的生長、遷移和侵襲。Sheng等［19］研究發(fā)現(xiàn) Eph B1在結(jié)直腸中低分化腺癌中高表達，Eph B1的表達下調(diào)和結(jié)直腸癌的分化和浸潤深度有關，表達下調(diào)越明顯，惡性程度越高；表達下調(diào)的越多，浸潤深度越深甚至達漿膜外脂肪組織。Chiu等［20］提示Eph B3在惡性程度高的結(jié)直腸癌中表達顯著下降，研究者將Eph B3轉(zhuǎn)染至HT-29人結(jié)腸癌細胞中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的生長受到明顯抑制。Kumar等［21］發(fā)現(xiàn)敲除Eph B4會抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，Eph B4存在調(diào)節(jié)腫瘤的血管發(fā)生和腫瘤細胞生成的潛力。而筆者最近通過檢測Eph B6在結(jié)直腸癌組織及其周圍正常組織的表達，發(fā)現(xiàn)Eph B6在大腸癌細胞中表達下調(diào)，多見于中晚期病例及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示Eph B6在結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中可能有一定抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及發(fā)展的作用。

以上實驗證明了Eph B受體與大腸癌的表達和腫瘤的浸潤程度以及遠端轉(zhuǎn)移呈負相關，與腫瘤組織的分化程度以及存活率呈正相關，提示Eph B對于腫瘤的生長具有抑制作用，提示了Eph B可能是結(jié)直腸癌潛在的抑癌基因。

5 Eph基因是潛在的結(jié)直腸癌治療新靶點

由于Eph基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后中可能發(fā)揮一定作用，國內(nèi)外已有研究人員開始將它作為腫瘤生物治療的新靶標。Yamaguchi等［22］用Eph A2肽加強型樹突狀細胞疫苗治療鼠結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)此疫苗可以通過增加CD8+和CD4+的T細胞功能發(fā)揮長效抗腫瘤效應。Xia等［23］報道利用RNA干擾或反義寡核苷酸技術(shù)敲除Eph B4編碼的癌蛋白，使腫瘤細胞生長、遷移和侵襲受到明顯抑制并誘導凋亡。Abéngozar等［24］研究表明，抗 Ephrin B2 治療會減少小鼠體內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)生成并降低新生血管的形成，引起血管和淋巴管生成的急劇減少，針對Ephrin B2的特異性抗體，聯(lián)合現(xiàn)有的抗血管生成藥物，可以作為一種治療癌癥和和血管生成相關疾病的有效治療手段。Lee等［25］利用在 HT-29人結(jié)直腸癌細胞株里接種雞胚絨毛尿囊膜，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的生長和血管生成受到苯基苯乙烯酮的顯著抑制，苯基苯乙烯酮通過抑制多種RTK受體發(fā)揮抗血管生成及治療癌癥的重要作用。Landen等［26］利用特異性抗體來中和Eph A2以及小片段干擾性RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾Eph A2表達等方法，配合紫杉類藥物治療卵巢癌等腫瘤，結(jié)果顯示可抑制腫瘤生長和腫瘤血管形成，并提高了患者生存率。目前，大腸癌基因治療的核心問題是靶向性，朱役等［27］利用納米材料構(gòu)建載有靶向VEGF mRNA的siRNA質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)納米基因載體具有較高的包封率及轉(zhuǎn)染率，可有效降低大腸癌細胞株 SW620中VEGF mRNA的表達量。利用基因技術(shù)，找到個體不同的致病靶點，采用個體化的基因治療是大腸癌治療的發(fā)展方向之一。

目前研究證實Eph基因?qū)S持生物胚胎發(fā)育、調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突導向和控制血管生成等方面都具有重要作用，同時在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展和預后中亦發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外已有很多大腸癌中 Eph表達譜的研究，有關Eph在結(jié)直腸癌的基因治療的研究也在不斷深入，但Eph與其配體對大腸癌的復雜的調(diào)控機制尚未完全明確，相信隨著有關研究的深入和技術(shù)的進步，可為進一步闡明大腸癌發(fā)生、發(fā)展，包括藥物治療和分子靶向治療提供新的前景。

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