楊鑫，范家恒，段甯耀，趙風云

(昆明理工大學食品工程研究中心，云南 昆明，650500)

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹側耳，是近年來在我國發(fā)展較快的工廠化栽培珍稀食用菌新品種［1］。杏鮑菇肉質肥厚，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，經常食用具有降血脂、降膽固醇、增強機體免疫力的功效，備受消費者的青睞［2］，成為我國近年來發(fā)展最快的食用菌品種之一。杏鮑菇優(yōu)良菌種的有效保藏，減少在儲藏過程中雜菌污染和菌種退化，對于提高企業(yè)生產效率具有重要意義。

蜂膠是西方蜜蜂(Apismellifera)采集植物樹脂，并混入蜂蠟、花粉及蜜蜂腺體分泌物后經蜜蜂咀嚼加工而成的一種黏稠物質［3］。研究發(fā)現，蜂膠的抑菌活性［4］、抗氧化活性［5］、殺蟲性［6］、抗腫瘤［7］等藥理學活性與其中的黃酮類化合物有密切關系，因此黃酮類化合物的含量常作為蜂膠質量控制的一個重要指標。

Sawaya 等人發(fā)現，不同提取方法和提取溶劑獲得的蜂膠，其化學成分和抑菌活性各有不同［8］。Garedew 比較了多個國家蜂膠提取物的抗菌效果，發(fā)現蜂膠醇提物抗菌活性最高［9］。本試驗用蜂膠的乙醇提取液對杏鮑菇及常見污染菌的抑制作用進行了研究，探討以蜂膠的天然抑菌能力在杏鮑菇菌種保藏和生產過程中防止雜菌污染的可能性。本研究可為用天然抗菌劑防止杏鮑菇菌種污染，預防菌種退化，延長菌種保藏提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

粗蜂膠:采于云南西雙版納，-20℃下冷凍24 h，粉碎備用;杏鮑菇:實驗室保藏菌種。

污染菌:為從污染的試管斜面中分離獲得，經初步鑒定，霉菌為青霉屬菌(Penicillium spp. )，細菌為革蘭氏陽性桿菌。

馬鈴薯綜合培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium，PDA):馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，Mg-SO40.15%，瓊脂2%，pH 自然。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(beef-protein agar medium，BPA):牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 1.5%，瓊脂2%，pH 自然。

1.2 儀器與設備

AL204 電子分析天平，中國梅特勒-托利多(上海)有限公司;UV -2550 紫外-可見分光光度計，日本島津公司;ES-315 高壓滅菌鍋，日本TOMY KOGYO 公司;KQ-500DB 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠提取液的制備

乙醇常溫提取法:稱取10 g 粗蜂膠于三角瓶中，分別加75%、85%、95%乙醇各75 mL，浸提1 h 后，45 kHz 超聲波處理15 min，取出30℃浸提24 h，浸提后以5 000 r/min 離心15 min，用濾紙過濾，得到蜂膠提取液。

乙醇熱提法:稱取10 g 粗蜂膠于三角瓶中，分別加75%、85%、95%乙醇各75 mL，浸提1 h 后，45 kHz超聲波處理15 min，取出60℃浸提24 h，浸提后以5 000 r/min 離心15 min，用濾紙過濾，得到蜂膠提取液。

1.3.2 黃酮含量的測定

分別吸取蘆丁標準液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加6 mL 水，加質量分數為5%的NaNO3溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加質量分數10% NaOH 溶液10 mL，加水稀釋至刻度，放置15 min，用UV-2550 紫外-可見分光光度計在515 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線［10］。

黃酮含量的測定:用移液槍量取1mL 6 種不同醇提工藝的蜂膠提取液，用95%乙醇定容于100 mL 容量瓶中，各取1 mL 分別置于25 mL 容量瓶中，加水至6 mL，其余按蘆丁標準曲線操作步驟處測定其吸光度，計算出樣品中總黃酮含量。

1.3.3 蜂膠提取液抑菌試驗

將6 種蜂膠提取液，用蒸餾水分別稀釋成0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的濃度。稀釋成不同的濃度梯度，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，收集濾液進行抑制試驗，方法如下:

杏鮑菇、霉菌:吸取1 mL 蜂膠稀釋液用無菌L 棒涂布于接種于PDA 平板，接種杏鮑菇和青霉菌，28℃恒溫培養(yǎng)，空白組為蒸餾水，72 h 后測定菌落直徑，每組實驗設3 個平行，計算抑制率。

細菌:制備濃度為1 ×106CFU 細菌菌懸液，涂布于BPA 平板上，37℃恒溫培養(yǎng)，待其長滿培養(yǎng)基后，用打孔器取直徑為6 mm 的菌塊，然后接種至涂布有蜂膠稀釋液的BPA 平板上，空白組為蒸餾水，48 h 后測定抑菌圈直徑，每組實驗設3 個平行，計算抑制率。

2 結果與分析

2.1 蜂膠的黃酮含量

以蘆丁作為標品，繪制標準曲線得回歸方程為y=10.95x-0.0042(R2=0.999 7)，式中:y 為濃度，mg/mL;x 為吸光值。依據此方程可求出蜂膠提取液的黃酮含量。結果如表1 所示，75%的乙醇熱提法提取的黃酮含量顯著高于其他提取方法，為10.51mg/ml;相同乙醇濃度時，熱提比常溫提得到的黃酮含量差異不顯著。乙醇濃度的高低對提取率的影響較顯著，相同提取溫度時，75%的乙醇濃度得到的黃酮含量最多，與吳玉敏得出的70 ～80%乙醇濃度對黃酮的提取效果最好相一致［11］。本試驗的黃酮含量偏低，可能與采集的蜂膠為粗蜂膠，蜂蠟等雜質含量過高有關。

表1 6 種蜂膠醇提工藝的黃酮含量對比Table 1 Comparison of the flavonoids content of six propolis ethanol-extractions

2.2 蜂膠醇提工藝對杏鮑菇及污染菌的抑制作用

由圖1、圖2 和圖3 可知，蜂膠提取液對杏鮑菇、霉菌和細菌的抑制作用趨勢相似，隨著蜂膠提取液濃度增加，抑制率增大，抑制作用增強;6 種工藝獲得的蜂膠提取液，均對杏鮑菇及污染菌有抑制作用，抑菌效果最優(yōu)的醇提工藝是75%的乙醇熱提，在蜂膠提取液濃度為80%時，對細菌的抑菌百分比達到100%(致死濃度)。

圖1 不同的蜂膠醇提工藝對杏鮑菇的抑制曲線Fig.1 The restrain curve of different propolis ethanol-extraction process to Pleurotus eryngii

圖2 不同的蜂膠醇提工藝對霉菌的抑制曲線Fig.2 The restrain curve of different propolis ethanol-extraction process to Streptomyces

圖3 不同的蜂膠醇提工藝對細菌的抑制曲線Fig.3 The restrain curve of different propolis ethanol-extraction process to bacterial

對比蜂膠提取液對杏鮑菇、霉菌和細菌的抑菌效果可知:蜂膠提取物對細菌的抑制作用最強，其次是杏鮑菇，對霉菌的抑制作用最弱。說明在杏鮑菇菌種保藏中，添加適量的蜂膠提取液，可有效抑制細菌的污染，但對控制霉菌的污染沒有太大效果。

2.3 黃酮含量和蜂膠提取物抑菌效果的相關性分析

對蜂膠中的黃酮含量和蜂膠提取物對杏鮑菇及污染菌的抑菌效果進行相關性分析。由圖4 可知，杏鮑菇、霉菌和細菌的抑制率與黃酮含量的相關系數R12、R22、R32均大于0.8，說明黃酮含量和抑菌效果有相關性，黃酮含量增加影響著抑菌效果，黃酮含量越高的蜂膠提取液抑菌效果越強，與Pepeljnjak 等的結論，蜂膠抗菌效果和蜂膠中黃酮類物質含量成正比的結論相一致［12］。也進一步驗證了，黃酮類物質是一種重要的抗菌活性成分［13］。

圖4 黃酮含量和杏鮑菇及污染菌抑制作用的相關性分析Fig.4 Flavonoid content，Pleurotus eryngii and contaminating bacteria inhibition of correlation analysis

3 結論

本研究以云南西雙版納的粗蜂膠為原料，進行75%、85%、95%的乙醇常溫浸提和熱浸提，測定蜂膠提取液的黃酮含量，并進行杏鮑菇及污染菌的抑制作用研究，結果表明:75%的乙醇熱提法提取的黃酮含量最多，蜂膠提取液對細菌有較強的抑制作用，但對霉菌、杏鮑菇的抑制效果較差，杏鮑菇、霉菌和細菌的抑制率與黃酮含量的相關系數均大于0.8，有較強的相關性。本研究表明:在杏鮑菇菌種保藏和子實體的保鮮時，添加適量的蜂膠提取液，可有效抑制細菌的污染。

［1］ 李志洲. 杏鮑菇多糖的提取［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(3):154 -158.

［2］ 劉凌岱，王希，周謝，等. 杏鮑菇脯的加工工藝研究［J］. 安徽農業(yè)科學，2012，12(4):2 301 -2 303.

［3］ Bankova V S，Castro S L，Marcucci M C，et al. Propolis:recent advances in chemistry and plant origin［J］. Apidologie，2000，31(1):3 -15.

［4］ Popova M，Silici S，Kaftanoglu O，et al. Antibacterial activity of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical composition［J］. Phytomedicine，2005，12(3):221 -228.

［5］ Lima B，Tapia A，Luna L，et al. Main Flavonoids，DPPH activity，and metal content allow determination of the geographical origin of propolis from the province of San Juan(Argentina)［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(7):2691 -2698.

［6］ Prytzyk E，Dantas A P，Salomao K，et al. Flavonoids and trypanocidal activity of Bulgarianpropolis［J］. Journal of Ethnopharmacology，2003，88(3):189 -193.

［7］ Sulaiman G M，Ad＇Hiah A H，Al-Sammarrae K W，et al.Assessing the anti-tumour properties of Iraqi propolis in vitro and in vivo［J］. Food and Chemical Toxicology，2012，50(5):1 632 -1 641.

［8］ Sawaya A，Souza K S，Marcucci M C. Analysis of the composition of Brazilian propolis extracts by chromatography and evaluation of their in vitro activity against Grampositive bacteria［J］. Brazilian Journal of Microbiology，2004，35(2):104 -109.

［9］ Garedew A，Schmolz E，Lamprecht I. Microbiological and calorimetric investigations on the antimicrobial actions of different propolis extracts:an in vitro approach［J］. Thermochimica Acta，2004，422(2):115 -124.

［10］ 彭增起，張夢寒，姚蕊，等. 蜂膠液體中類黃酮化合物的HPLC 測定和抗氧化性能研究［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，3(9):86 -88.

［11］ 吳玉敏. 蜂膠中黃酮提取方法及工藝優(yōu)化研究［D］.成都:四川農業(yè)大學，2007:20 -22.

［12］ Pepeljnjak S，Kosalec I. Galangin expresses bactericidal activity against multiple-resistant bacteria:MRSA，Enterococcus spp. and Pseudomonas aeruginosa［J］. FEMS Microbiology Letters，2004，240(1):111 -116.

［13］ Popova M，Silici S，Kaftanoglu O，et al. Antibacterial activity of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical composition［J］. Phytomedicine，2005，12(3):221 -228.