方盼盼，宮璀璀，倉寶成，李正民，李宗杰，李文莉，朱傳杰，王迎濤

（1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院科研中心，河南 鄭州 450052；2.中國人民解放軍153中心醫(yī)院中心實驗室，河南 鄭州 450042）

急性高原反應(yīng)（acute mountain sickness，AMS）的發(fā)生風(fēng)險率與低氧環(huán)境和海拔高度上升的速度有著密切的關(guān)聯(lián)性［1］。當(dāng)海拔高度為4000m時，上升速度為91m·h－1，AMS的發(fā)生率為54%；上升速度為1268m·h－1，其發(fā)生率為73%；上升速度達(dá)到1647m·h－1時，其發(fā)生率增加 到 89%［2］。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia－inducible factor，HIF）是在低氧狀態(tài)下啟動應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，對于機(jī)體發(fā)育和某些疾病，如癌癥、衰老和組織缺氧等均起著重要的作用［3］。目前研究［4］顯示：對局部氧濃度敏感的轉(zhuǎn)錄因子基因已有20多種，其中的核轉(zhuǎn)錄因子 Kappa B（nuclear factor kappa B，NF－κB）在缺氧狀態(tài)下可被激活。NF－κB家族由7個蛋白質(zhì)亞基組成，包括RelA（p65）、RelB、c－Rel、NF－κB1（p105／p50）和NF－κB2（p100／p52），由5個不同的基因所編碼，因此可以組成不同的異源或同源二聚體，起到調(diào)節(jié)NF－κB DNA的作用。在正常情況下，NF－κB經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路中的p65／p50異二聚體處于無活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子和缺氧刺激時，活化的p65／p50異二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄［4－5］。Oliver等［6］發(fā)現(xiàn)：低氧環(huán)境主要通過經(jīng)典途徑誘導(dǎo)NF－κB活化的增強(qiáng)。缺氧狀態(tài)下，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia－inducible factror－1α，HIF－1α）的表達(dá)水平受 NF－κB 直接調(diào)控［3］，而 HIF－1α對 NF－κB的表達(dá)存在一定的反饋?zhàn)饔茫?］。但在急進(jìn)高原缺氧狀態(tài)下，HIF－1α與NF－κB蛋白質(zhì)亞基RelA表達(dá)及與AMS的相關(guān)性研究尚未見報道。本研究通過觀察急進(jìn)4400m高原前后正常人外周血單個核細(xì)胞中 HIF－1α和RelA表達(dá)水平的變化，探討急進(jìn)高海拔地區(qū)對相關(guān)基因和蛋白的影響，為AMS的預(yù)防、診斷和治療提供有價值的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），鼠抗人多克隆抗體及抗鼠二抗試劑盒（Santa Cruz），Trizol（Invitrogen），PCR 試劑盒（TIANGEN），NF－κB、HIF－1α及內(nèi)參引物由上海生工公司合成。

1.2 研究對象 2010年4月某部赴青海省玉樹抗震士兵30名，其中男性23名，女性7名，年齡22～34歲，乘汽車急行軍于24h內(nèi)到達(dá)海拔4000m高度，48h抵達(dá)玉樹。于出發(fā)前和到達(dá)玉樹后分別采集外周靜脈血，以枸櫞酸鈉抗凝。

1.3 單個核細(xì)胞的提取 采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞，加入相當(dāng)于單個核細(xì)胞懸液5倍體積的預(yù)冷PBS（每毫升PBS中加入磷酸酶抑制劑0.05mL，以限制進(jìn)一步的蛋白質(zhì)修飾）洗滌2次，176×g離心9min后棄去上清液，加入預(yù)冷的PBS將單個核細(xì)胞懸液的體積還原至1mL，采用血細(xì)胞分析儀計數(shù)單個核細(xì)胞數(shù)量。

1.4 細(xì)胞核蛋白和總RNA的提取 采用Trizol試劑提取細(xì)胞核蛋白和總RNA，所分離得到的單個核細(xì)胞在加入Trizol試劑后樣品呈現(xiàn)勻漿化，細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成 Trizol試劑用異丙醇沉淀后，冰預(yù)冷DEPC處理水配制的75%乙醇1mL洗滌沉淀物，棄乙醇，室溫干燥后將沉淀溶于適量DEPC水中，采用核酸定量儀檢測RNA濃度，純度達(dá)到要求后進(jìn)行后續(xù)的實驗。cDNA的合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄程序：25℃、5min，42℃、60min，70℃、5min，4℃緩沖30min。

1.6 RT－PCR 方法檢測 HIF－1α和 RelA mRNA表達(dá)水平 將上述方法逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA作為模板，擴(kuò)增目的基因片段。建立25.0μL的反應(yīng)體系：cDNA 2.0μL，MasterMix 12.5μL，上下游引物的混合液1.0μL，ddH2O 9.5μL。設(shè)計引物：HIF－1α，sense 5′－AATGAAGTGTACCCTAACTAGCCG－3′，anti－sense 5′－GTTCACAAATCAGCACCAAGC－3′；NF－κB，sense 5′－AAGAAGCGGGACCTGGAGCA－3′，anti－sense 5′－GGGCACGATTGTCAAAGATGG－3′；β－actin，sense 5′－GAGCTACGAGCTGCCTGACG－3′，anti－sense 5′－CCTAGAAGCATTTGCGGTGG－3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)處理5min；95℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃、5min；4℃緩沖60min。退火溫度相同。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)Alpha Imager HP軟件掃描HIF－1α和RelA mRNA及相應(yīng)β－actin的RT－PCR電泳圖，計算其均值與βactin內(nèi)參照的比值。

1.7 Western blotting法檢測 HIF－1α蛋白表達(dá)水平 應(yīng)用Trizol提取各組蛋白質(zhì)。采用Bradford法測定并調(diào)節(jié)各組總蛋白濃度。制備SDS－PAGE凝膠，電泳條件120V、2.5h。應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀4℃下轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NCM）上，轉(zhuǎn)膜條件58V、4h，將NCM與1∶1000稀釋 的各種一抗室溫下反應(yīng)2h，再與1∶200稀釋的二抗（鼠IgG－HRP）室溫下反應(yīng)1h。加入DAB底物溶液，顯色20～30min，同時進(jìn)行β－actin的內(nèi)參照，陽性條帶呈現(xiàn)棕色后用水終止反應(yīng)。應(yīng)用Image J免疫印跡處理學(xué)軟件掃描，計算HIF－1α蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值。

1.8 AMS的判定 按照GB1098291《急性高原反應(yīng)的診斷和處理原則》對進(jìn)入玉樹高原的士兵進(jìn)行體檢、詢診、診斷及確診是否發(fā)生AMS。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，HIF－1αmRNA和蛋白表達(dá)水平及RelA mRNA表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以表示，進(jìn)入高原前后比較采用t檢驗；HIF－1α mRNA與 RelA mRNA 或 HIF－1α蛋白及 HIF－1α和RelA mRNA表達(dá)與AMS發(fā)生率的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。

2 結(jié) 果

2.1 士兵急進(jìn)海拔4000m高原后AMS發(fā)生率及發(fā)病程度 本組30名士兵中，有18例發(fā)生AMS，發(fā)生率為60.0%。其中輕度反應(yīng)10例（55.6%），中度反應(yīng)5例（27.8%），重度反應(yīng)3例（16.7%）。

2.2 士兵急進(jìn)高原前后外周血單個核細(xì)胞中HIF－1α和RelA mRNA表達(dá)水平 分離抗凝全血中單個有核細(xì)胞，提取總RNA，采用RT－PCR法檢測單個核細(xì)胞中HIF－1α和RelA mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與進(jìn)入高原前比較，進(jìn)入高原48h后RelA 和 HIF－1αmRNA表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見表1。

表1 急進(jìn)高原前后士兵外周血單個核細(xì)胞中HIF－1α和RelA mRNA的表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of HIF－1αand RelA mRNA in mononuclear cells of peripheral blood in soldiers before and after ascentting of plateau （n＝30，）

表1 急進(jìn)高原前后士兵外周血單個核細(xì)胞中HIF－1α和RelA mRNA的表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of HIF－1αand RelA mRNA in mononuclear cells of peripheral blood in soldiers before and after ascentting of plateau （n＝30，）

＊ P＜0.01compared with before ascentting.

mRNA RelA mRNA Before ascentting Group HIF－1α 0.458±0.155 0.815±0.126 After ascentting 1.377±0.314＊ 1.262±0.231＊

2.3 士兵急進(jìn)高原前后外周血單個核細(xì)胞中HIF－1α蛋白表達(dá)水平 分離抗凝全血中單個有核細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，采用Western blotting方法分析，結(jié)果顯示：進(jìn)入高原前HIF－1蛋白表達(dá)水平為0.84±0.13，進(jìn)入高原后為0.99±0.12，進(jìn)入高原后HIF－1蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01）。

2.4 不同性別士兵RelA mRNA 和 HIF－1α mRNA及蛋白表達(dá)水平的差異性 對不同性別組士兵外周血單個核細(xì)胞中HIF－1mRNA及蛋白表達(dá)水平、RelA mRNA表達(dá)水平進(jìn)入高原前后的差值進(jìn)行組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），表明性別對 RelA mRNA、HIF－1mRNA及蛋白表達(dá)水平無明顯影響。見表2。

表2 不同性別士兵急進(jìn)高原前后單個核細(xì)胞中HIF－1α mRNA及蛋白表達(dá)水平和RelA mRNA表達(dá)水平差值Tab.2 Differential values of expression levels of HIF－1α mRNA and protein and RelA mRNA in mononuclear cells before and after ascentting of plateau in different gender soldiers （n＝30，）

表2 不同性別士兵急進(jìn)高原前后單個核細(xì)胞中HIF－1α mRNA及蛋白表達(dá)水平和RelA mRNA表達(dá)水平差值Tab.2 Differential values of expression levels of HIF－1α mRNA and protein and RelA mRNA in mononuclear cells before and after ascentting of plateau in different gender soldiers （n＝30，）

Group Differential value HIF－1αprotein HIF－1αmRNA RelA mRNA Male 0.18±0.15 0.86±0.38 0.44±0.26 Female 0.10±0.10 1.06±0.19 0.45±0.25

2.5 HIF－1αmRNA 和 RelA mRNA 表達(dá)水平的相關(guān)性分析 HIF－1αmRNA和Re1AmRNA表達(dá)水平均為正態(tài)分布，Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：相關(guān)系數(shù)（r）為0.806（P＜0.01），表明兩者呈顯著正關(guān)關(guān)系。

2.6 HIF－1αmRNA與蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析 HIF－1αmRNA和蛋白表達(dá)水平均為正態(tài)性分布，但是散點(diǎn)圖顯示相關(guān)性不佳，Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：r＝0.081（P＞0.05），表明兩者無相關(guān)性。

2.7 HIF－1α和RelA表達(dá)與AMS發(fā)生率相關(guān)性分析 將HIF－1α蛋白的檢測結(jié)果與AMS發(fā)生率進(jìn)行相關(guān)性分析，r＝0.875（P＜0.01），HIF－1α蛋白表達(dá)與 AMS發(fā)病程度高度相關(guān)。HIF－1α mRNA和RelA mRNA與AMS發(fā)生率之間的r分別為0.298（P＞0.05）和0.238（P＞0.05），表明不存在相關(guān)性。

3 討 論

AMS是人體急進(jìn)高原暴露于低氧環(huán)境后產(chǎn)生的各種病理性反應(yīng)，常見癥狀有頭痛、失眠、食欲減退、疲倦和呼吸困難等，且發(fā)病率較高［8］。當(dāng)人從平原快速進(jìn)入海拔3000m以上的高原時有50%～75%的人出現(xiàn)AMS，一般經(jīng)3～10d習(xí)服后癥狀逐漸消失，病情嚴(yán)重者可引起腦水腫或肺水腫［9］。引起AMS的基礎(chǔ)原因是低壓性低氧，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。

HIF－1α是受低氧調(diào)控的HIF亞基，慢性低氧時，HIF－1α在機(jī)體對低氧的適應(yīng)過程中發(fā)揮重要的核心作用，當(dāng)HIF－1α的表達(dá)水平發(fā)生快速上調(diào)時，將對組織細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷。在正常的氧環(huán)境下，HIF－1α在脯氨酸羥化酶的作用下發(fā)生羥基化作用，然后與腫瘤抑制蛋白（von hippel lindau protein，pVHL）結(jié)合，募集泛素蛋白，組成泛素連接蛋白酶復(fù)合體發(fā)生泛素化作用，并通過蛋白酶體使 HIF－1α迅速降解。在低氧環(huán)境下，HIF－1α不發(fā)生羥基化，也不與pVHL結(jié)合，因此結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的HIF－1α與其異聚體 HIF－1α結(jié)合在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄，對缺氧缺血應(yīng)激的適應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控［10－11］。本研究結(jié)果顯示：與急進(jìn)高原前比較，急進(jìn)海拔4400m高原48h后，正常人外周血單個核細(xì)胞中HIF－1αmRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著增加。Steve等［12］報道：應(yīng)用H2O2和活性氧ROS可誘導(dǎo)人肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）中HIF－1αmRNA和蛋白表達(dá)水平增加，但 HIF－1α mRNA的表達(dá)峰值出現(xiàn)在2h，隨后表達(dá)量逐漸減低，而蛋白質(zhì)表達(dá)峰值出現(xiàn)在4h，二者之間存在表達(dá)時間點(diǎn)的差異。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在到達(dá)海拔4400m高原48h后，正常人外周血單個核細(xì)胞中HIF－1αmRNA和蛋白表達(dá)水平無相關(guān)性，是否與表達(dá)時間點(diǎn)的不同有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

盡管HIF是一個細(xì)胞對于低氧環(huán)境反應(yīng)調(diào)控的核心因子，但對于低氧環(huán)境的改變而表現(xiàn)出的敏感反應(yīng)還有其他多種轉(zhuǎn)錄因子參加，并起著直接或間接的調(diào)控作用［13］。研究［4］發(fā)現(xiàn)：在缺氧條件下多種細(xì)胞類型中NF－κB信號通路被激活。本研究結(jié)果顯示：急進(jìn)海拔4400m高原48h之后，正常人外周血單個核細(xì)胞中RelA（p65）mRNA的表達(dá)水平明顯高于急進(jìn)高原前的表達(dá)水平。

Taylor等［14－15］報道：在低氧炎癥發(fā)生中，HIF和 NF－κB之間存在cross－talk。在慢性炎癥疾病中，組織的缺氧導(dǎo)致羥化酶的活性降低，誘導(dǎo)HIF依賴性適應(yīng)基因表達(dá)的激活。炎癥因子配體同時激活NF－κB通路和炎癥因子、抗凋亡基因的表達(dá)通路。在cross－talk的兩信號通路中存在著依賴 NF－κB的 HIF－1mRNA 表達(dá)上調(diào)和依賴 HIF－1的NF－κB的活性增加。NF－κB信號通路通過HIF－1羥化酶途進(jìn)行調(diào)控。本研究結(jié)果顯示：RelA與HIF－1α具有相關(guān)性，提示在其之間可能存在cross－talk現(xiàn)象。

本文作者通過對正常人外周血單個核細(xì)胞中RelA、HIF－1αmRNA和 HIF－1α蛋白表達(dá)水平與AMS相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)：HIF－1α蛋白表達(dá)水平與AMS發(fā)生率呈正相關(guān)關(guān)系，而RelA和 HIF－1α mRNA的表達(dá)水平與AMS發(fā)生率無相關(guān)性，是否是由于mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)時間點(diǎn)的差異所引起，還有待探討。本研究結(jié)果提示：HIF－1α蛋白表達(dá)水平可作為預(yù)測和干預(yù)AMS的監(jiān)測指標(biāo)。但本研究例數(shù)尚少，還待進(jìn)一步探討。

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