田 聰，余以剛，肖性龍*，李建龍，吳 暉

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

細(xì)菌的活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but nonculturable state，VBNC)是活菌的一種特殊存在狀態(tài)，細(xì)菌在外界環(huán)境壓力條件下，失去在常規(guī)培養(yǎng)基生長(zhǎng)繁殖的能力，但是仍然具有代謝活性，在一定的條件下能夠復(fù)蘇。VBNC菌的一個(gè)重要特征是復(fù)蘇，只有細(xì)胞能夠提高代謝活性并且恢復(fù)可培養(yǎng)性才能夠有效證明VBNC狀態(tài)是細(xì)菌保留活性的一種形式。目前的研究結(jié)果并不能將所有的VBNC菌都復(fù)蘇，復(fù)蘇是一個(gè)復(fù)雜的過程，并非直接去除誘導(dǎo)因子即能實(shí)現(xiàn)[1]。

大腸桿菌O157：H7(Escherichia coli O157：H7)是一種常見的食源性致病菌，能夠通過食物和水源傳播，對(duì)人類的安全構(gòu)成威脅[2]。當(dāng)遇到如低溫、高滲透壓、pH值、紫外線輻射和改變營養(yǎng)等不良環(huán)境條件時(shí)，E.coli O157：H7會(huì)進(jìn)入VBNC[3]，細(xì)菌在這種狀態(tài)下仍然具有新陳代謝活性，保留毒性基因，但是常規(guī)方法無法培養(yǎng)，造成漏檢[4]，許多VBNC菌在合適的外界條件下可以實(shí)現(xiàn)復(fù)蘇[5]。

目前對(duì)于VBNC的復(fù)蘇研究普遍集中在弧菌上，對(duì)于VBNC狀態(tài)的大腸桿菌復(fù)蘇研究較少[6]。E.coli O157：H7在低溫寡營養(yǎng)條件下誘導(dǎo)21d后進(jìn)入VBNC狀態(tài)，通過在平板培養(yǎng)基中加入過氧化氫酶或者丙酮酸鹽等物質(zhì)，2d內(nèi)平板計(jì)數(shù)增加到104～105CFU/mL，研究者[7]認(rèn)為通過添加的物質(zhì)能夠降解代謝副產(chǎn)物H2O2，促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)活性達(dá)到復(fù)蘇的目的，而不是通過提供細(xì)胞培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)物質(zhì)恢復(fù)可培養(yǎng)能力。

Ohtomo等[8]利用高鹽環(huán)境誘導(dǎo)E.coli CE273進(jìn)入VBNC狀態(tài)，菌落數(shù)在19h內(nèi)減少90%，當(dāng)解除壓力環(huán)境后，細(xì)胞在2h內(nèi)恢復(fù)可培養(yǎng)性，菌落數(shù)達(dá)到誘導(dǎo)前濃度。Pinto等[9]首次利用在基本培養(yǎng)基中加入氨基酸或者改變溫度的方法，使得4℃條件下誘導(dǎo)的E.coli成功復(fù)蘇。對(duì)于大腸桿菌的不同株型的VBNC菌的復(fù)蘇方法并不相同，復(fù)蘇的差異性和復(fù)雜性使得復(fù)蘇條件的篩選顯得尤為重要。

目前對(duì)VBNC狀態(tài)E.coli O157：H7復(fù)蘇研究較少，本實(shí)驗(yàn)研究低溫因素對(duì)其VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)的作用，對(duì)不同復(fù)蘇條件進(jìn)行篩選，結(jié)合利用熒光定量PCR與熒光顯微鏡觀察等方法，探討E.coli O157：H7的復(fù)蘇能力。本實(shí)驗(yàn)利用常規(guī)簡(jiǎn)便的復(fù)蘇方法，對(duì)誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC狀態(tài)的E.coli O157：H7體外復(fù)蘇，復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)成功同時(shí)可以作為VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)成功的佐證。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)條件

大腸桿菌E.coli O157：H7(ATCC6589)，為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

細(xì)菌培養(yǎng)采用LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L，pH值調(diào)至7.0，培養(yǎng)基經(jīng)過121℃、20min滅菌后使用。E.coli O157：H7接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min搖床過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600nm≈1.0)。液體培養(yǎng)基中添加1.8g/100mL的瓊脂粉即固體培養(yǎng)基，用于平板法測(cè)可培養(yǎng)菌數(shù)。

1.2 試劑與儀器

吖啶橙、蘇丹黑 美國Amresco公司；萘啶酮酸、酵母膏、吐溫-80 美國Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司；PCR Amplification Kit 日本TaKaRa公司；革蘭氏染色液 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；Olympus CX-31落射熒光顯微鏡 日本奧林帕斯公司；ABI7500熒光定量PCR儀器 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 VBNC狀態(tài)E.coli O157：H7的誘導(dǎo)

將過夜培養(yǎng)后處于對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的E.coli O157：H7采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)得菌液濃度為109CFU/mL。菌懸液8000×g離心2min，用無菌水重懸，接入30mL誘導(dǎo)液中，加入無菌水調(diào)整細(xì)菌濃度達(dá)到106CFU/mL左右。誘導(dǎo)液為：LB液體培養(yǎng)基(－18℃)和生理鹽水溶液(－18℃)。誘導(dǎo)過程中定期每隔2d用平板計(jì)數(shù)法、吖啶橙熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法(acridine orange direct count，AODC)和活菌直接計(jì)數(shù)法(direct viable count，DVC)定量檢測(cè)可培養(yǎng)菌數(shù)、總菌數(shù)和活菌數(shù)的變化，設(shè)3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 復(fù)蘇條件的篩選

取3mL誘導(dǎo)結(jié)束剛進(jìn)入VBNC狀態(tài)的E.coli O157：H7于8000×g離心2min，用無菌水重懸，接入3mL無菌水中，分別用4種方法復(fù)蘇。同時(shí)取3mL無菌Milli-Q水作為陰性對(duì)照組。

寶劍遞出去的那一瞬間，奇怪的事情發(fā)生了——對(duì)方不避不擋,只是留給了岳無影一個(gè)平靜的微笑，微笑中充滿了對(duì)生的眷戀和對(duì)死亡的坦然接受。

1)直接升溫復(fù)蘇：VBNC菌液直接置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中200r/min振蕩培養(yǎng)，2d后平板計(jì)數(shù)。

2)添加營養(yǎng)物質(zhì)升溫復(fù)蘇：VBNC菌液中加入體積分?jǐn)?shù)為25%無菌酵母浸膏，25℃、180r/min培養(yǎng)，2d后平板計(jì)數(shù)。

3)添加化學(xué)物質(zhì)升溫復(fù)蘇：VBNC菌液中加入體積分?jǐn)?shù)為8%無菌吐溫-80，37℃、200r/min培養(yǎng)，2d后平板計(jì)數(shù)。

4)熱激復(fù)蘇：VBNC菌液置于45℃水浴15s，恢復(fù)室溫后平板計(jì)數(shù)。

1.3.3 熒光顯微鏡觀察

VBNC狀態(tài)菌的誘導(dǎo)和檢測(cè)以及復(fù)蘇過程用AODC和DVC法分別檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)和活菌總數(shù)，同時(shí)用熒光顯微鏡觀察不同時(shí)期的細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。從誘導(dǎo)環(huán)境中取菌液10倍稀釋，取合適濃度的菌液1mL于8000×g轉(zhuǎn)速條件下離心2min，用無菌水重懸。洗滌后的菌液中加入100μL的1g/L吖啶橙溶液，暗處染色5min。吸取10μL染色完畢的菌液，均勻地滴在置于無自發(fā)熒光的載玻片中心處微孔濾膜上，微孔濾膜之前用2g/L的蘇丹黑溶液染色以去除背景熒光。制成的樣本用落射熒光顯微鏡觀察結(jié)果[10]。當(dāng)可培養(yǎng)數(shù)降為0時(shí)，連續(xù)檢測(cè)3d仍為0，DVC檢測(cè)顯示有活菌存在時(shí)，認(rèn)為誘導(dǎo)環(huán)境中的菌體進(jìn)入VBNC狀態(tài)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正?；罹鳛閷?duì)照組進(jìn)行熒光觀察。復(fù)蘇成功后采用相同的方法檢測(cè)，并進(jìn)行熒光觀察。

1.3.4 細(xì)菌DNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

取500μL菌液10000×g離心3min收集菌體，采用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，得到終體積為50μL的PCR反應(yīng)模板。

利用ABI 7500 Real Time PCR System檢測(cè)。E.coli O157：H7上游引物5’-CTACAGGTGAAGGTGGAATGGT-3’(22bp)，下游引物5’-GTAGCCTATAACGTCATGCCAAT-3’(2 3 b p)，以 及T a q M a n 水 解 探 針5’-F A MTCACGAATGACAAAACACTTTATGAC-BHQ1[11]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL：10×(NH4)2SO4Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl23.5μL，上下游引物各1μmol/L，探針0.5μmol/L，25mmol/L dNTPs 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μg/μL，DNA模板2μL，補(bǔ)加無菌水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃、5s，60℃、40s(收集熒光)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后40℃保溫。3次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均循環(huán)閾值(Ct)和樣本標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)

改變溫度是誘導(dǎo)VBNC菌的常用方法，不同細(xì)菌對(duì)于低溫的耐受性不同，當(dāng)有其他不利因素，如寡營養(yǎng)協(xié)同誘導(dǎo)時(shí)，有利于細(xì)菌形成VBNC狀態(tài)。初始濃度為6.5×106CFU/mL的E.coli O157：H7菌液于低溫(－18℃)的作用下分別在富營養(yǎng)(LB液體培養(yǎng)基)和寡營養(yǎng)(生理鹽水)環(huán)境條件下誘導(dǎo)，可培養(yǎng)數(shù)分別在誘導(dǎo)的第15天和第18天降為0。同時(shí)，通過AODC法檢測(cè)的總菌數(shù)在整個(gè)誘導(dǎo)過程中保持穩(wěn)定，而DVC法測(cè)得的活菌數(shù)緩慢降低，至誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)活菌數(shù)分別下降1～2個(gè)數(shù)量級(jí)(圖1)，即進(jìn)入VBNC狀態(tài)。說明兩種環(huán)境均能夠誘導(dǎo)E.coli O157：H7進(jìn)入VBNC狀態(tài)，低溫是VBNC狀態(tài)的E.coli O157：H7誘導(dǎo)的重要影響因子。E.coli的活性與溫度相關(guān)是因?yàn)榈蜏啬軌驅(qū)е滦玛惔x活性的減弱，可以延緩對(duì)于細(xì)胞的損害[12]，低溫有利于E.coli進(jìn)入VBNC狀態(tài)[13]。同時(shí)，結(jié)果顯示在低溫條件下營養(yǎng)條件對(duì)于E.coli O157：H7的VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)影響不大。

圖 1 E.coli O157:H7在LB培養(yǎng)基和生理鹽水中的菌數(shù)變化Fig.1 Change in cell counts of E. coli O157: H7 in LB broth and physiological saline

2.2 VBNC狀態(tài)E.coli O157：H7的復(fù)蘇

2.2.1 平板計(jì)數(shù)法驗(yàn)證復(fù)蘇

對(duì)于低溫寡營養(yǎng)方法誘導(dǎo)的VBNC菌，去除誘導(dǎo)時(shí)的不利環(huán)境因子，提高溫度和添加營養(yǎng)物質(zhì)可能會(huì)使VBNC菌復(fù)蘇。取剛進(jìn)入VBNC菌株進(jìn)行復(fù)蘇，2d后經(jīng)檢測(cè)結(jié)果顯示，升溫、添加25%酵母浸膏和添加8%吐溫-80均能夠使VBNC菌恢復(fù)可培養(yǎng)狀態(tài)(表1)。通過涂布平板發(fā)現(xiàn)，平板上長(zhǎng)出的單菌落比正常的單菌落略小，可能與VBNC狀態(tài)下細(xì)菌細(xì)胞縮小有關(guān)。復(fù)蘇后的濃度達(dá)到105CFU/mL左右，比誘導(dǎo)前的細(xì)菌濃度106CFU/mL低1個(gè)數(shù)量級(jí)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)果。細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)15d后，采用相同的方法復(fù)蘇，4種方法均不能使VBNC菌恢復(fù)可培養(yǎng)性。說明E.coli O157：H7只能維持VBNC一段時(shí)間，之后便會(huì)進(jìn)入死亡期[14]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明細(xì)菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)和維持時(shí)間可能與誘導(dǎo)環(huán)境和細(xì)菌自身對(duì)于環(huán)境的抵御適應(yīng)能力有關(guān)。VBNC狀態(tài)的復(fù)蘇與誘導(dǎo)方法、復(fù)蘇條件選擇和VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)和維持時(shí)間有關(guān)，是一個(gè)復(fù)雜的過程。

表1 VBNC狀態(tài)E.coli O157:H7復(fù)蘇結(jié)果Table 1 Resuscitation of VBNC E. coli O157:H7

2.2.2 熒光顯微鏡驗(yàn)證復(fù)蘇

圖 2 不同狀態(tài)E.coli O157:H7熒光圖像(標(biāo)尺為10μm)Fig.2 Fluorescence images of E. coli O157:H7 at different states (bar represents 10 μm)

圖2為不同狀態(tài)下E.coli O157：H7的熒光顯微圖像。菌懸液經(jīng)過吖啶橙染色后，經(jīng)熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后進(jìn)入VBNC狀態(tài)的菌體變小，縮小接近于球狀，正常菌體為桿狀，菌體比較大。經(jīng)過吸收營養(yǎng)處理的VBNC菌體染色后經(jīng)熒光顯微鏡觀察，部分菌體體積增大1～2倍左右，認(rèn)為是VBNC狀態(tài)細(xì)菌，少數(shù)細(xì)菌體積不變，認(rèn)為是死菌。DVC法使用萘啶酮酸抑制DNA復(fù)制，在營養(yǎng)物質(zhì)作用下，活細(xì)胞只生長(zhǎng)不分裂，可以通過染色后觀察從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌的檢測(cè)[15]。復(fù)蘇后的E.coli O157：H7經(jīng)過AODC法處理后，菌體形態(tài)和大小與正常菌體基本相同。

2.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩種誘導(dǎo)環(huán)境中E.coli O157：H7在正常狀態(tài)、VBNC狀態(tài)和復(fù)蘇后的菌數(shù)變化，不同狀態(tài)下的樣本Ct值略有不同。由圖3可知，E.coli O157：H7從誘導(dǎo)到復(fù)蘇整個(gè)過程中，總菌數(shù)變化不大，VBNC狀態(tài)時(shí)總菌數(shù)略有降低，與AODC法檢測(cè)結(jié)果相同。同時(shí)，熒光定量PCR結(jié)果證明復(fù)蘇后通過平板法檢測(cè)到的菌落不是雜菌污染，進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)蘇成功。

圖 3 熒光定量PCR檢測(cè)不同狀態(tài)下的E.coli O157:H7Fig.3 qPCR detection of E. coli O157: H7 at different states

3 結(jié) 論

菌液濃度為106CFU/mL的E.coli O157：H7分別在富營養(yǎng)和寡營養(yǎng)以及－18℃低溫的作用下，15d和18d內(nèi)分別進(jìn)入VBNC狀態(tài)，37℃直接升溫復(fù)蘇、25℃加入25%酵母液和37℃加入8%吐溫-80均能在2d內(nèi)使VBNC狀態(tài)E.coli O157：H7復(fù)蘇，可培養(yǎng)菌數(shù)到達(dá)104～106CFU/mL，接近于誘導(dǎo)前濃度。對(duì)于VBNC菌的檢測(cè)結(jié)合了平板計(jì)數(shù)法、熒光顯微鏡觀察法和熒光定量PCR技術(shù)，有效、快速、準(zhǔn)確地驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，克服了傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法對(duì)于VBNC菌的漏檢缺陷。

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