黃汝清，何蓉蓉，歐仕益,*

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

玉米是我國(guó)主要的糧食作物之一，主要用于生產(chǎn)玉米淀粉、玉米酒精、玉米油及玉米糖等[1]。玉米皮是生產(chǎn)淀粉的主要副產(chǎn)物，約占玉米原料的10%～14%[1]。目前玉米皮主要用作飼料，未得到充分利用。玉米皮含有大量膳食纖維和酚類(lèi)物質(zhì)，其中總阿魏酸含量約為3%[2]，主要通過(guò)酯鍵與細(xì)胞壁多糖或木質(zhì)素交聯(lián)[3]，是制備阿魏酰低聚糖酯的理想原料。

自由基可誘發(fā)癌癥、糖尿病、心血管疾病，自身免疫疾病、神經(jīng)退行性病變等，抗氧化劑能預(yù)防或改善這些疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4]。阿魏酸是一種良好的抗氧化劑，它具有抗血栓、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、抗菌消炎等功能，日本已批準(zhǔn)用作食品抗氧化劑，我國(guó)和美國(guó)可用于功能性食品[5]。阿魏酰低聚糖酯是低聚糖的糖羥基與阿魏酸羧基酯化形成的一類(lèi)化合物，水溶性優(yōu)于阿魏酸；由于它具有阿魏酸結(jié)構(gòu)，預(yù)示其具有抗氧化功能，本實(shí)驗(yàn)對(duì)玉米皮制備的阿魏酰低聚糖酯進(jìn)行清除自由基和測(cè)定還原力和抗氧化能力指數(shù)的實(shí)驗(yàn)，探討阿魏酰低聚糖酯的抗氧化能力，為其可用作功能性成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮購(gòu)自長(zhǎng)春大成集團(tuán)有限公司。

淀粉酶、蛋白酶 諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；阿魏酸、蛋氨酸 廣州市齊云生物技術(shù)公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司；氯化硝基四氮唑藍(lán) 中國(guó)前進(jìn)化學(xué)試劑廠；核黃素 上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠；2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、 6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、熒光素鈉 日本和光純藥株式會(huì)社；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；UV-9600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；HH-4恒溫水浴鍋 江蘇金壇市宏體儀器廠；LC-20AT液相色譜儀 日本Shimadzm公司；ICS-2500離子色譜儀 美國(guó)Dionex公司；KDC-12低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；Genios多功能熒光酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 阿魏酰低聚糖酯的制備

利用淀粉酶、蛋白酶去除玉米皮中的淀粉和蛋白質(zhì)，制得去淀粉去蛋白玉米皮[6]。稱取50g去淀粉去蛋白玉米皮，按1：10(m/V)加入6g/L的草酸溶液，置蒸汽滅菌器中121℃蒸煮20min，冷卻后過(guò)濾，收集濾液。用Amberlite XAD-2樹(shù)脂吸附濾液，分別用去離子水和50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，收集乙醇水洗脫液，濃縮，冷凍干燥得阿魏酰低聚糖酯[7-8]。

1.3.2 原料與阿魏酰低聚糖酯成分測(cè)定

去淀粉去蛋白玉米皮中阿魏酸含量參照歐仕益等[9]的方法測(cè)定。由于阿魏酰低聚糖酯暫無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品，通常以阿魏酰低聚糖酯中阿魏酸含量來(lái)表示樣品的含量，測(cè)定方法參照王遠(yuǎn)[10]的方法；樣品總糖含量的測(cè)定按文獻(xiàn)[11]進(jìn)行；樣品的單糖組分測(cè)定參照李國(guó)強(qiáng)等[12]的方法。并對(duì)樣品進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析。

1.3.3 阿魏酰低聚糖酯對(duì)·OH的清除能力[13]

于10mL具塞比色管中依次加入2mL不同濃度的阿魏酰低聚糖酯溶液、0.5mL 9mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、0.5mL 9mmol/L氯化亞鐵溶液、6.5mL去離子水和0.5mL 8.8mmol/L過(guò)氧化氫溶液，混勻后，置37℃水浴中反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度。以阿魏酸為對(duì)比物質(zhì)?！H的清除率按式(1)計(jì)算。

式中：A樣品為樣品溶液的吸光度；A對(duì)照為去離子水代替氯化亞鐵溶液的吸光度；A空白為去離子水代替樣品溶液測(cè)定吸光度。

1.3.4 阿魏酰低聚糖酯對(duì)DPPH自由基的清除能力[14]

于試管中加入2mL不同濃度的阿魏酰低聚糖酯溶液和2mL 0.5mmol/L的DPPH溶液(以95%乙醇配制)，混勻后，室溫下避光反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后在波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度。以阿魏酸作為對(duì)比物質(zhì)。DPPH自由基的清除率按式(2)計(jì)算。

式中：A樣品為樣品溶液的吸光度；A對(duì)照為95%乙醇代替DPPH的吸光度；A空白為去離子水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.5 阿魏酰低聚糖酯對(duì)O2－·的清除能力[15]

于試管中加入0.4mL不同濃度的阿魏酰低聚糖酯溶液、0.4mL 0.5mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)、0.4mL 0.13mol/L蛋氨酸、0.4mL 2×10-5mol/L核黃素、0.4mL 7.0×10-4mol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)和1mL去離子水，混勻后，光照20min，以黑暗終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后在波長(zhǎng)560nm處測(cè)定吸光度。以阿魏酸作為對(duì)比物質(zhì)。O2－·的清除率按式(3)計(jì)算。

式中：A樣品為樣品溶液的吸光度；A對(duì)照為不進(jìn)行光照的實(shí)驗(yàn)組的吸光度；A空白為去離子水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.6 阿魏酰低聚糖酯還原力測(cè)定[16-17]

于試管中依次加入1mL不同濃度的阿魏酰低聚糖酯溶液、2.5mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)和2.5mL 1%鐵氰化鉀，混勻后，置50℃水浴避光反應(yīng)20min；再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，離心10min。吸取2.5mL上清液，加入2.5mL去離子水、0.5mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后，室溫下反應(yīng)10min。反應(yīng)結(jié)束后在波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光度。以阿魏酸作為對(duì)比物質(zhì)。

1.3.7 阿魏酰低聚糖酯抗氧化能力指數(shù)測(cè)定[18-20]

于96孔板的微孔中加入20μL不同濃度的阿魏酰低聚糖酯溶液、20μL 75mmol/L磷酸鉀緩沖溶液、140μL AAPH(至終濃度為12.8mmol/L)和20μL熒光素鈉(至終濃度為63nmol/L)，置37℃的熒光酶標(biāo)儀中開(kāi)始測(cè)定。每2min測(cè)定一個(gè)點(diǎn)，至熒光強(qiáng)度衰減為零為止。以緩沖溶液代替AAPH(－AAPH)和以緩沖溶液代替抗氧化劑(+AAPH)作兩個(gè)對(duì)照組。以阿魏酸作為對(duì)比物質(zhì)?？寡趸芰χ笖?shù)(ORAC)是以20μmol/L的Trolox在熒光衰退曲線下對(duì)應(yīng)的保護(hù)積分面積作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照計(jì)算。

式中：S為熒光衰退曲線下的面積；c為試劑或樣品濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料與阿魏酰低聚糖酯的成分

按1.3.2節(jié)的方法測(cè)得，去淀粉去蛋白玉米皮中阿魏酸含量為2.70%。凍干獲得的阿魏酰低聚糖酯中阿魏酸含量為4.88%，總糖含量為93.94%，樣品中單糖組分包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖，相對(duì)百分含量依次為10.22%、3.67%、28.65%和57.46%。阿魏酰低聚糖酯的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖如圖1所示。色譜峰A信號(hào)最強(qiáng)，在它對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖中，正離子模式下m/z 349.4[M+Na+]，負(fù)離子模式下m/z 325.4[M－H+]，兩者可共同推斷出該色譜峰對(duì)應(yīng)成分的相對(duì)分子質(zhì)量為326。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為326的玉米皮阿魏酰低聚糖酯，其結(jié)構(gòu)是阿魏酰阿拉伯糖酯[21]。

圖 1 阿魏酰低聚糖酯的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of feruloylated oligosaccharides by LC-MS

2.2 阿魏酰低聚糖酯對(duì)·OH的清除能力

圖 2 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸對(duì)·OH的清除率Fig.2 Comaprative evaluation of hydroxyl free radical scavenging feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

Fe2+和H2O2反應(yīng)生成的·OH，與水楊酸結(jié)合產(chǎn)生紫色物質(zhì)；若加入抗氧化劑清除·OH，可減少紫色物質(zhì)的生成量，通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)計(jì)算抗氧化劑對(duì)·OH的清除率。由圖2可知，在1～10mmol/L范圍內(nèi)，阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸對(duì)·OH的清除能力均隨著樣品濃度的升高而逐漸增強(qiáng)；相同濃度條件下，阿魏酰低聚糖酯的·OH清除率明顯大于阿魏酸，說(shuō)明阿魏酰低聚糖酯對(duì)·OH的清除能力優(yōu)于阿魏酸。

2.3 阿魏酰低聚糖酯對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖 3 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.3 Comaprative evaluation of DPPH radical scavenging capacity of feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基，溶液呈深紫色，抗氧化劑與DPPH自由基反應(yīng)使溶液顏色變淺，通過(guò)測(cè)定吸光度可衡量抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除能力。由圖3可知，阿魏酰低聚糖酯具有顯著的清除DPPH自由基效果。在濃度小于0.6mmol/L時(shí)，阿魏酰低聚糖酯對(duì)DPPH自由基的清除率隨著濃度的增大而增大；當(dāng)濃度達(dá)到0.6mmol/L后，清除率變化趨于平穩(wěn)，阿魏酸亦表現(xiàn)出類(lèi)似的變化趨勢(shì)。當(dāng)濃度為2mmol/L時(shí)，阿魏酰低聚糖酯對(duì)DPPH自由基的清除率為93.80%，說(shuō)明阿魏酰低聚糖酯具有良好的清除DPPH自由基的能力。

2.4 阿魏酰低聚糖酯對(duì)O2－·的清除能力

圖 4 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸對(duì)O2－·的清除率Fig.4 Comaprative evaluation of superoxide anion free radical scavenging activity of feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

蛋氨酸和核黃素在光照下產(chǎn)生的O2－·，與氯化硝基四氮唑藍(lán)反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)，抗氧化劑可減少藍(lán)紫色物質(zhì)的產(chǎn)生[22]，因此通過(guò)測(cè)定吸光度變化可評(píng)價(jià)抗氧化劑對(duì)O2－·的清除效果。由圖4可知，阿魏酰低聚糖酯對(duì)O2－·的清除能力存在濃度依賴關(guān)系，變化趨勢(shì)與對(duì)·OH的清除作用相似。在低濃度(＜3mmol/L)時(shí)，阿魏酰低聚糖酯的清除能力比阿魏酸的更為顯著，隨著濃度升高，阿魏酰低聚糖酯的清除率增長(zhǎng)速度減慢。當(dāng)濃度達(dá)到5mmol/L時(shí)，阿魏酰低聚糖酯對(duì)O2－·的清除率達(dá)到98.05%，阿魏酸的清除率為75.96%，阿魏酰低聚糖酯的清除效果極佳。

2.5 阿魏酰低聚糖酯的還原力

圖 5 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸的還原力Fig.5 Comaprative evaluation of reducing power of feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

抗氧化劑與鐵氰化鉀反應(yīng)，將后者還原為亞鐵氰化鉀，生成的亞鐵氰化鉀再與Fe3+反應(yīng)生成亞鐵氰化鐵，通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑的還原能力，吸光度越大，還原能力越強(qiáng)。由圖5可知，低濃度時(shí)，阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸的還原力比較接近，隨著濃度的升高，吸光度逐漸增大，兩者的還原力逐漸增大，且前者的還原力比后者強(qiáng)，增長(zhǎng)速度更快。當(dāng)濃度為1mmol/L時(shí)，阿魏酰低聚糖酯的還原力約為阿魏酸的1.7倍。表明阿魏酰低聚糖酯是良好的供電子體，對(duì)Fe3+有良好的還原能力。

2.6 阿魏酰低聚糖酯抗氧化能力指數(shù)

圖 6 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸熒光衰退曲線Fig.6 Fluorescence decay curves of feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

AAPH產(chǎn)生的自由基可使熒光素鈉發(fā)生熒光淬滅，加入抗氧化劑則可延緩熒光淬滅速度。由圖6可知，與熒光自然衰退曲線相比，阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸均表現(xiàn)出了延緩熒光衰減速度的能力。計(jì)算得阿魏酸的ORAC值為2.62μmol Trolox/μmol，阿魏酰低聚糖酯的ORAC值為4.77μmol Trolox/μmol，約為前者的1.8倍。說(shuō)明相同濃度的阿魏酰低聚糖酯比阿魏酸具有更高的抗氧化能力。

3 結(jié) 論

研究了玉米皮阿魏酰低聚糖酯的體外抗氧化能力，結(jié)果顯示，阿魏酰低聚糖酯對(duì)·OH、DPPH自由基和O2－·均具有良好的清除能力，尤其對(duì)DPPH自由基和O2－·的清除能力最為顯著，最高清除率可達(dá)90%以上。樣品的還原力和抗氧化能力指數(shù)都優(yōu)于阿魏酸的測(cè)定結(jié)果，分別為阿魏酸的1.7倍和1.8倍。

阿魏酰低聚糖酯具有抗氧化性質(zhì)，這主要與其中的阿魏酸結(jié)構(gòu)有關(guān)，酚羥基是主要的抗氧化基團(tuán)。阿魏酰低聚糖酯表現(xiàn)出比阿魏酸更高的抗氧化能力，原因可能與阿魏酰低聚糖酯中的低聚糖結(jié)構(gòu)有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)大豆低聚糖具有抗氧化作用[23]。低聚糖結(jié)構(gòu)可能使得阿魏酸水溶性提高，擴(kuò)大了阿魏酰低聚糖酯的應(yīng)用范圍。

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