貝亦江，王 揚，何 豐，任勝蘭

(1.浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，浙江 杭州 310012；2.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023)

喹乙醇是一種飼料添加劑，對大多數(shù)動物有明顯的致畸作用，對人也有潛在致畸形，致突變，致癌作用，因此在世界范圍內(nèi)都被禁止或限制用作飼料添加劑[1]。3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是喹乙醇主要代謝產(chǎn)物之一，在體內(nèi)相對穩(wěn)定，是國際食品法典委員會認(rèn)定的標(biāo)示殘留物之一，可作為殘留分析監(jiān)控的目標(biāo)物質(zhì)。

常用M Q C A 的檢測方法是高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法[2-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法[8-13]。雖然LC-MS/MS法提高了定性、定量的準(zhǔn)確性和靈敏度，但是儀器價格昂貴，檢測成本較高，在推廣程度上受到限制。HPLC法在使用上較為方便、快捷，靈敏度能達(dá)到檢測要求，但是按國標(biāo)法操作，通過萃取和反萃取，生物體的蛋白質(zhì)和脂類難以有效去除，造成上機液的污染，被檢物質(zhì)本身也在此過程中損失較多，對檢測結(jié)果和儀器本身都不利。

本實驗參考前人的研究，采用與國標(biāo)法不同的HPLC法對不同類型水產(chǎn)品(魚類、甲殼類、爬行類)中MQCA殘留量進行測定，對樣品前處理過程進行優(yōu)化，以期提高回收率，得出方法的檢出限和定量限，為獸藥監(jiān)管部門對喹乙醇流通的監(jiān)管提供參考方法和依據(jù)，也為喹乙醇及其代謝物在生物體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究提供實驗手段[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MQCA標(biāo)準(zhǔn)品(＞94.0%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙酸乙酯、甲酸(均為色譜純) 美國Tedia公司；鹽酸(分析純) 杭州化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉(分析純) 溫州潤華化工實業(yè)公司。

MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取適量MQCA標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相(甲醇-1.0%甲酸溶液(40：60，V/V))溶解，配制成100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光冷藏，有效期12個月。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取1.00mL MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，配制成1.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液，4℃避光冷藏，有效期3個月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用流動相稀釋至1.00mL，配制成0.01、0.05、0.25、0.5、1.0μg/mL系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

提取液：2.0mol/L鹽酸水溶液；淋洗液：0.05mol/L乙酸鈉-甲醇溶液(稱取4.10g乙酸鈉用甲醇稀釋至1.00L)；洗脫液：2%甲酸-乙酸乙酯溶液(量取20.00mL甲酸用乙酸乙酯稀釋至1.00L)。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀(配可變波長紫外檢測器) 美國Agilent公司；Oasis MAX 3cc固相萃取柱 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-1.0%甲酸溶液(40：60，V/V)；流速1.0mL/min；柱溫30.0℃；進樣量20.0μL；檢測波長320nm。

1.3.2 樣品制備

取新鮮或冷凍的供試組織，去除脂肪和筋膜，魚肉、龜鱉肉去皮，蝦、蟹去殼，切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻，充分勻漿。

1.3.3 樣品提取

稱取5.00g樣品置于50mL離心管中，加入15mL 2.0mol/L鹽酸溶液，根據(jù)試樣物理性質(zhì)，漩渦混合1～2min?；旌贤戤吅螅糜跉庠『銣卣袷幤髦?0℃恒溫酸解30min，然后8000r/min離心10min。上清液過濾收集于另一支50mL離心管中。將過濾完畢的殘渣再次加入10mL 2.0mol/L鹽酸溶液，8000r/min離心5min，上清液過濾后收集于同一支50mL離心管中。

1.3.4 樣品凈化

固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化。待活化液流至填料上層以下，加入樣品提取液，控制流速不大于3mL/min。待樣品提取液全部流出后用10mL 0.05mol/L乙酸鈉-甲醇溶液淋洗固相萃取柱。待固相萃取柱中溶液全部流出后，抽真空5min。用10mL含2%甲酸的乙酸乙酯溶液洗脫。洗脫液收集于15mL玻璃離心管中，40℃氮氣吹干。殘渣加入1mL流動相渦旋振蕩2min溶解，過0.22μm濾膜后待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖如圖1A所示，陰性樣品添加20μg/kg MQCA得到譜圖如圖1B、1C所示。

圖 1 1.0μg/mL喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)品(A)、陰性樣品添加水平20μg/kg(B)和陰性樣品(C)色譜圖Fig.1 Chromatogram of 1.0 μg/mL MQCA standard (A), blank sample spiked with 20 μg/kg MQCA (B) and blank sample (C)

2.2 樣品分析

向不同水產(chǎn)品(魚類、爬行類和甲殼類)樣品添加3個水平的MQCA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個水平設(shè)6個平行，進行回收實驗。方法的回收率和精密度見表1。

由表1可見，在3個加標(biāo)水平下，回收率在71.0%～ 86.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.84%～7.32%之間。

表1 回收率和精密度記錄Table 1 Recovery rate and precision of the method

2.3 喹乙醇代謝物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

對0.01、0.05、0.2、0.5、1.0μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進行色譜分析，按其所得峰面積的平均值與對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。喹乙醇代謝物在質(zhì)量濃度0.01～1.0μg/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=43.972x＋0.0321，r=0.9998。

2.4 檢出限和定量限

在色譜條件下，按試驗方法規(guī)定的稱樣量和定容體積進樣測定。根據(jù)檢測限測定信噪比應(yīng)大于3，定量限測定信噪比大于10的原理，計算檢出限為4.0μg/kg，定量限為12.0μg/kg，與國標(biāo)方法[2]相符合，完全滿足國內(nèi)水產(chǎn)品中MQCA的檢測要求。

2.5 提取方式的優(yōu)化

現(xiàn)階段，水產(chǎn)品喹乙醇代謝物殘留量的檢測主要依據(jù)農(nóng)業(yè)部1077號公告-5—2008《水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測定高效液相色譜法》[2]。該方法雖然較為簡便，但是對于樣品的前處理考慮得并不周全。經(jīng)過實際操作發(fā)現(xiàn)有以下缺點：1、在萃取和反萃取的過程中，試樣容易損失；2、當(dāng)試樣組織密度較小，懸浮或漂浮于提取液中時，容易堵塞濾膜，造成過濾的不充分，從而使上機液不潔凈，非但影響回收率而且會對色譜柱造成損害。

張小軍等[4]提出，用鹽酸水解提取MQCA，陰離子固相萃取柱凈化。實驗發(fā)現(xiàn)，提取過程中增加一步提取+振蕩＋離心，并將酸解時間從60min縮短至30min，回收率顯著提高。而過濾的過程并不是必須的，因為過濾會降低回收率。只有樣品提取液非常不潔凈，有肉眼能分辨的顆粒狀、絮狀懸浮物將引起SPE柱堵塞的時候，才需要過濾。增加提取步驟縮短酸解時間以及是否過濾引起的回收率變化見表2、3。

由表2可見，增加提取步驟、縮短酸解時間前后回收率平均提高6.4%。由表3可見，不進行過濾相對于過濾，回收率平均提高13.0%。但由于實際樣品并非像空白樣品般鮮有雜質(zhì)，因此在回收率符合要求的情況下，樣品均要過濾。

表2 增加提取步驟、縮短酸解時間前后的回收率變化Table 2 Influence of more complicated extraction procedure and shorted hydrolysis time on the recovery of MQCA

表3 空白樣品過濾前后的回收率變化Table 3 Influence of filtration on the recovery of MQCA

2.6 凈化方式的優(yōu)化

固相萃取的主要目的是去除上機液雜質(zhì)并使得上機液澄清而不使色譜柱受損。實驗發(fā)現(xiàn)，提取液通過SPE柱的速度對回收率有顯著影響，速度控制在不大于1滴/s。若提取液過快通過SPE柱，則介質(zhì)對目標(biāo)化合物的吸附將不充分，造成目標(biāo)化合物的損失，淋洗和洗脫同理。在洗脫的過程中，注意洗脫液的用量不能太少，10～15mL較為合適(小于10mL洗脫不充分，而大于15mL則要超出玻璃離心管的容積)。

3 結(jié) 論

本實驗對前人關(guān)于水產(chǎn)品中MQCA殘留量的檢測方法進行探討，對前人的方法加以改進，增加了一次酸解提取步驟，減少了酸解時間；實驗結(jié)果表明，樣品不過濾時的回收率較過濾時差異較大，為水產(chǎn)品MQCA殘留量檢測的方法提供了建設(shè)性意見。

[1] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部公告第168號 飼料藥物添加劑使用規(guī)范[S].

[2] 全國水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會. 農(nóng)業(yè)部1077號公告-5—2008 水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測定高效液相色譜法[S].

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