馮 進(jìn)，李 敏，曾曉雄，李春陽*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003)

藍(lán)莓又名篤斯越橘、藍(lán)漿果等，原產(chǎn)于北美[1]，按照植物學(xué)分類，屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘亞科越橘屬(Vaccinium spp.)多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓葉作為藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物，具有藥用價(jià)值，其性溫、味苦，有解毒之功效[2]。藍(lán)莓葉中含有大量多酚物質(zhì)[3]，主要組分為綠原酸及其衍生物、咖啡酸、槲皮素甙以及低聚原花青素等[4-5]。近年來，藍(lán)莓葉的生理功能在國(guó)際上受到廣泛關(guān)注，Takesshita等[6]研究證明藍(lán)莓葉中聚合度為8和9的原花青素對(duì)丙肝病毒(HCV) RNA表達(dá)有很強(qiáng)的抑制作用，Squpien等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉提取物對(duì)白血病敏感細(xì)胞HL60及其兩種抗藥亞種具有抑制作用。Louis等[9]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓葉多酚可以增強(qiáng)C2C12細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力和βTC-tet細(xì)胞的葡萄糖刺激胰島素分泌(GSIS)能力，并可以減少活化葡萄糖導(dǎo)致的PC12細(xì)胞凋亡，因此具有抗糖尿病的功能。此外，研究還發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉多酚提取物有降血脂[10]、降血壓[11]的生理活性。

大孔樹脂近年來被廣泛用于多酚類物質(zhì)分離與富集，具有吸附快、解吸快、選擇性強(qiáng)、吸附容量大、易于再生等優(yōu)點(diǎn)[12]。李超等[13]用AB-8大孔樹脂對(duì)大葉金黃草總黃酮進(jìn)行了純化，純化后黃酮純度達(dá)到66.16%；魏改芹等[14]用HPD100大孔樹脂對(duì)香青蘭中木犀草素進(jìn)行了純化，木犀草素的含量由純化前的0.15%增加到純化后的2.7%。另外，HP20、DM130等大孔樹脂對(duì)多酚的分離純化效果也較好[15-16]。

本研究選取了8種對(duì)多酚分離純化效果較好的樹脂，從中篩選出一種對(duì)藍(lán)莓葉多酚具有良好吸附和解吸性能的樹脂，考察此樹脂對(duì)藍(lán)莓葉多酚的靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附與解吸性能及主要影響因素，建立藍(lán)莓葉多酚的純化方法，并用高效液相色譜-DAD檢測(cè)及在線質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-DAD-mass spectrometry，HPLCDAD-MS)分析方法對(duì)藍(lán)莓葉多酚成分進(jìn)行了初步分析，為藍(lán)莓葉多酚的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“燦爛”藍(lán)莓(bright well，兔眼藍(lán)莓，Vaccinium ashei Reade)藍(lán)莓葉采自江蘇省南京市溧水縣，洗凈后于－70℃條件下保藏。

大孔樹脂D101、DM130、AB-8、HPD100、HPD400、HPD400A、HPD750、HPD826 滄州寶恩化工有限公司。8種樹脂的具體參數(shù)見表1。

無水乙醇、無水碳酸鈉等化學(xué)試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸、Folin-Ciocalteu試劑 美國(guó)Sigma公司。

表1 8種大孔樹脂的結(jié)構(gòu)功能參數(shù)Table 1 Physical characteristics of eight macroporous resins

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-Q臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；752S紫外-可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；PHS-2C數(shù)顯pH計(jì) 上海儀器儀表有限公司； FDU-1200冷凍干燥機(jī) 日本Eyela公司；1100高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀(帶自動(dòng)進(jìn)樣器)、Zorbax SB-C18反相色譜柱(4.6mm×250mm，5μm) 美國(guó)Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓葉多酚提取液的制備

冷藏藍(lán)莓葉液氮中磨碎，60%乙醇中室溫振蕩提取12h，5000×g離心30min，低溫蒸干，凍干，使用時(shí)配成不同質(zhì)量濃度的溶液。

1.3.2 多酚質(zhì)量濃度與純度的測(cè)定

1.3.2.1 多酚質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法[17]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=7.2110X＋0.0152，R2=0.9994。

多酚質(zhì)量濃度C0/(mg/mL)=C×N

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)液中多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；N為稀釋倍數(shù)。

1.3.2.2 多酚純度的測(cè)定

各取一定體積的提取液與洗脫液，減壓蒸餾至無醇味，凍干，稱量。

式中：C0為多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為溶液體積/mL；m為凍干后質(zhì)量/mg。

1.3.3 大孔樹脂的預(yù)處理[18]

樹脂用95%的乙醇浸泡24h后裝柱，并用95%的乙醇淋洗至無白色，5%鹽酸溶液與2%氫氧化鈉溶液分別浸泡并洗至中性。

1.3.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸

1.3.4.1 大孔樹脂對(duì)藍(lán)莓葉多酚吸附量、吸附率和解吸率的測(cè)定[19]

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的大孔樹脂3g，置于100mL具塞磨口三角瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的藍(lán)莓葉多酚提取液50mL，置于搖床(25℃，120r/min)振蕩24h進(jìn)行靜態(tài)吸附后，取上清液測(cè)定總多酚含量，按照下面公式計(jì)算吸附量和吸附率：

式中；Q為吸附量/(mg/g)；C0為起始質(zhì)量濃度/(mg/mL)；Cr為平衡質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為吸附溶液體積/mL；m為樹脂質(zhì)量/g；A為吸附率/%。

將充分吸附后的樹脂用蒸餾水洗凈至樹脂表面無提取溶液殘留，濾紙吸干樹脂表面的殘留溶液，然后置于100mL具塞三角瓶中，加入50mL無水乙醇，置于搖床(25℃，120r/min)振蕩解吸12h，充分解吸后，取上清液測(cè)定多酚含量，按照下式計(jì)算解吸率。

式中：Q為吸附量/(mg/g)；C為解吸后溶液中總多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為解吸液體積/mL；m為樹脂質(zhì)量/g。

1.3.4.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸動(dòng)力學(xué)曲線的繪制

稱取大孔吸附樹脂HPD400、HPD100、DM131各3.0g，裝入具塞磨口三角瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的提取溶液50mL，置于搖床上振蕩(25℃，120r/min)，靜態(tài)吸附24h。期間每隔一定時(shí)間取0.1mL，適當(dāng)稀釋，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度吸附量，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

將充分吸附后的樹脂用蒸餾水清洗至樹脂表面無提取溶液殘留，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，然后置于具塞三角瓶中，加入50mL無水乙醇，置于搖床(25℃，120r/min)振蕩解吸12h，期間每隔一定時(shí)間取0.1mL，測(cè)定多酚解吸率，繪制靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.4.3 HPD400樹脂Langmuir吸附等溫曲線測(cè)定

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的HPD400，分別加入不同質(zhì)量濃度的藍(lán)莓葉多酚提取液，置于搖床(25℃，120r/min)振蕩24h進(jìn)行靜態(tài)吸附后，取上清液測(cè)定多酚含量，計(jì)算吸附量。根據(jù)吸附平衡后吸附量與提取液中剩余的多酚質(zhì)量濃度之間的關(guān)系，得到該樹脂的Langmuir等溫吸附曲線。Langmuir等溫吸附公式：

式中：Qm為理論最大吸附量/(mg/g)；Qe為吸附達(dá)平衡后的吸附量/(mg/g)；Ce為吸附平衡后的多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；KL為吸附平衡常數(shù)。

1.3.4.4 靜態(tài)吸附與解吸條件的優(yōu)化

分別考察提取液多酚質(zhì)量濃度與提取液pH值對(duì)樹脂吸附的影響，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹脂解吸的影響。

1.3.5 HPD400樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸

1.3.5.1 上樣流速對(duì)吸附效果的影響

將預(yù)處理好的20g HPD400大孔樹脂濕法裝入玻璃層析柱(1.0cm×60cm)中。將藍(lán)莓葉多酚提取液(3mg/mL，pH2)以不同流速上柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，10mL/管分部收集流出液，測(cè)定泄漏點(diǎn)(流出液多酚質(zhì)量濃度為進(jìn)樣質(zhì)量濃度的1/10)時(shí)流出液體積，確定適宜上樣流速。

1.3.5.2 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響

將200mL優(yōu)選質(zhì)量濃度的藍(lán)莓渣多酚提取液以優(yōu)選上樣流速上柱，靜置1h后，用去離子水洗至流出液無色，用40%乙醇溶液以不同洗脫速度洗脫，分管收集洗脫液，通過測(cè)定每管多酚含量以及總多酚含量考察洗脫流速對(duì)樹脂解吸效果的影響。

1.3.6 HPLC-DAD-MS試驗(yàn)方法

1.3.6.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18反相色譜柱(4.6mm× 250mm，5μm)。

以含0.1% HAc的水為流動(dòng)相A，含0.1% HAc的甲醇為流動(dòng)相B，流速0.6mL/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μL，按照如下梯度洗脫：0～5min，5%～10% B；10～25min，10%～20% B；25～35min， 20%～23% B；35～45min，23%～28% B；45～60min，28%～35% B；60～75min，35%～50% B；75～80min，50%～55% B；80～85min，55%～75% B；85～90min，75%～35% B；90～95min，35%～5% B。采用DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm。

1.3.6.2 質(zhì)譜條件

霧化氣N230psi，干燥氣N210psi，毛細(xì)管溫度350℃，毛細(xì)管電壓(負(fù)離子模式下)3.0kV。質(zhì)量掃描范圍：m/z 200～2000。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 14.0軟件，采用ANOVA法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。選取P＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種大孔樹脂對(duì)藍(lán)莓葉多酚靜態(tài)吸附及解吸特性

表2 8種大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果Table 2 Results of static adsorption and desorption rates of eight macroporous resins

在相同試驗(yàn)條件下，測(cè)得各樹脂的靜態(tài)吸附、靜態(tài)解吸的結(jié)果如表2所示，吸附量較大的為非極性或者弱極性樹脂，如HPD100、HPD400、AB-8，原因可能是藍(lán)莓葉多酚組分屬于弱極性的物質(zhì)，與這類大孔樹脂具有特異性吸附。而HPD100、HPD400、DM130對(duì)藍(lán)莓葉多酚的解吸效果更好，這可能與其具有較大的比表面積有關(guān)[20]，選擇吸附量與解吸率均較好的HPD100、HPD400和DM130樹脂繪制靜態(tài)吸附與解吸動(dòng)力學(xué)曲線。

2.2 HPD400、HPD100、DM130吸附與解吸藍(lán)莓葉多酚動(dòng)力學(xué)特性

圖 1 HPD400、HPD100、DM130靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Kinetic curves of static adsorption of HPD400, HPD100 and DM130 macroporous resins

圖 2 HPD400、HPD100、DM130靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curves of static desorption of HPD400, HPD100 and DM130 macroporous resins

從圖1可以看出，HPD400在300min時(shí)達(dá)到吸附平衡，HPD100與DM130在400min左右達(dá)到吸附平衡，達(dá)到平衡時(shí)DM130的吸附量明顯低于其他兩種樹脂。從圖2可以看出，HPD400樹脂在140min左右達(dá)到解吸平衡，另外兩種在200min達(dá)到解吸平衡，HPD100與HPD400的解吸率差異不明顯，DM130的多酚解吸率較低。由于HPD400達(dá)到吸附與解吸平衡的時(shí)間較快，并且具有較高的吸附量和解吸率，因此選擇HPD400進(jìn)行后續(xù)的純化工作。

2.3 提取液多酚質(zhì)量濃度對(duì)HDP400大孔樹脂的影響

圖 3 藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度對(duì)吸附量的影響Fig.3 Effect of the concentration of blueberry leaves polyphenols on adsorption quantity

由圖3可以看出，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度在0.5～3mg/mL之間時(shí)，樹脂的吸附量隨著多酚質(zhì)量濃度的增加而迅速增加，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為3～5mg/mL時(shí)，吸附量無顯著變化。提高上樣量有利于提高樹脂的利用率，但是，上樣質(zhì)量濃度過高，上樣液會(huì)出現(xiàn)絮凝和沉淀，容易對(duì)樹脂造成污染和阻塞，降低其吸附能力[21]，因此，選擇上樣質(zhì)量濃度為3mg/mL。

2.4 HPD400樹脂的Langmuir吸附等溫線

由圖4可知，在本實(shí)驗(yàn)研究范圍內(nèi)Langmuir等溫線呈直線，R2=0.9868，基本符合Langmuir吸附理論，根據(jù)斜率和截距計(jì)算得出HPD400樹脂對(duì)藍(lán)莓葉多酚的最大吸附量Qm為75.19mg/g。由此可知HPD400大孔樹脂對(duì)藍(lán)莓葉多酚的吸附是單分子層的吸附[22]，故應(yīng)用較低質(zhì)量濃度的藍(lán)莓葉多酚溶液上樣，上樣質(zhì)量濃度過高不會(huì)增加吸附量，反而會(huì)造成多酚的損失。

圖 4 Langmuir吸附等溫曲線Fig.4 Langmuir adsorption isotherm

2.5 提取液pH值對(duì)樹脂吸附的影響

圖 5 pH值對(duì)靜態(tài)吸附量的影響Fig.5 Effect of pH on static adsorption quantity

如圖5所示，藍(lán)莓葉多酚在酸性條件下的吸附效果較好，pH2時(shí)的吸附效果最好。不同pH值可以改變目標(biāo)成分在溶液中的存在形式，影響其溶解度，并改變?nèi)芤簶O性，影響目標(biāo)成分與大孔樹脂的分子間的作用力[23]，藍(lán)莓葉中多酚大多屬于黃酮類物質(zhì)，并且含酚羥基較多，呈弱酸性，須在弱酸性條件下進(jìn)行吸附。

2.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸的影響

圖 6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靜態(tài)解吸率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on static desorption rate

從圖6可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)在0%～40%之間時(shí)，解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高增加較快，繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，解吸率變化不大，從節(jié)約資源的角度考慮，選擇40%乙醇溶液解吸。

2.7 上樣流速對(duì)吸附效果的影響

從圖7可以看出，上樣流速為1、2、3、4、5mL/min時(shí)，泄露點(diǎn)(流出液質(zhì)量濃度為上樣液質(zhì)量濃度1/10時(shí))分別出現(xiàn)在160、140、110、100、80mL附近。流速為1mL/min時(shí)泄露點(diǎn)出現(xiàn)較晚，但因?yàn)榱魉偬龔亩鴮?dǎo)致生產(chǎn)周期過長(zhǎng)。綜合考慮，選擇上樣流速為2mL/min。

圖 7 上樣流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響Fig.7 Effect of loading fl ow rate on kinetic adsorption

2.8 洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響

圖 8 HPD400樹脂吸附藍(lán)莓葉多酚洗脫曲線Fig.8 Desorption curve of blueberry leaves polyphenols from HPD400

圖 9 洗脫流速對(duì)解吸率的影響Fig.9 Effect of desorption fl ow speed on desorption rate of blueberry leaves polyphenols

從圖8可以看出，以0.5、1mL/min進(jìn)行洗脫得到的峰形均較窄，無明顯的拖尾現(xiàn)象，以1.5、2mL/min進(jìn)行洗脫得到的峰形較寬，且有著明顯的拖尾現(xiàn)象。從圖9可以看出，洗脫速率越快解吸率越低，這是由于在洗脫體積一定的情況下，洗脫速率過大，會(huì)導(dǎo)致洗脫劑未充分溶解樹脂中的多酚而過柱[24]，洗脫流速為0.5mL/min時(shí)，洗脫率最高，但是生產(chǎn)周期過長(zhǎng)，而洗脫速率提高到1mL/min時(shí)，解吸率下降不明顯，而生產(chǎn)周期可以縮短，所以本試驗(yàn)選擇洗脫速率為1mL/min。從圖8可以看出，當(dāng)洗脫體積為80mL時(shí)，藍(lán)莓葉多酚基本可以洗脫完全。

2.9 藍(lán)莓葉多酚純度的計(jì)算

藍(lán)莓葉多酚經(jīng)過HPD400樹脂純化后，多酚純度從38.75%提高到69.38%，說明HPD400大孔樹脂對(duì)藍(lán)莓葉多酚的純化效果較好，可以大幅度提高提取物的多酚含量。

2.10 HPLC-DAD-MS分析藍(lán)莓葉多酚成分

圖 10 藍(lán)莓葉多酚HPLC分析結(jié)果Fig.10 The result of HPLC analysis of blueberry leaves polyphenols

圖 11 峰1、2、3、4、5、8質(zhì)譜圖Fig.11 MS spectra of peaks 1, 2, 3, 4, 5 and 8

根據(jù)質(zhì)譜圖，峰1、2為綠原酸(chlorogenic acid)[5]，它們的出峰保留時(shí)間不同，應(yīng)該屬于兩種同分異構(gòu)體。另外，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量與出峰保留時(shí)間，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道[4-5,9,25]，推測(cè)峰3、4、5、8分別為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸(quercetin-3-O-glucuronide)、3,5-二-反式-咖啡?？鼘幩?3,5-di-O-caffeoylquinic acid)、3,4-二-反式-咖啡酰奎寧酸(3,4-di-O-caffeoylquinic acid)、槲皮素(quercetin)。

3 結(jié) 論

HPD400樹脂的靜態(tài)吸附量為52.95mg/g，解吸率95.96%，并且達(dá)到吸附與解吸平衡的時(shí)間較短，最適合藍(lán)莓葉多酚的純化。

當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為3mg/mL、pH 2、上樣流速為2mL/min時(shí)，HPD400樹脂對(duì)藍(lán)莓葉多酚的吸附量較大，為140mL。用80mL 40%乙醇以1mL/min的流速進(jìn)行洗脫時(shí)，解吸效果較好，解吸率為90.50%，且峰形對(duì)稱性較好，無明顯的拖尾現(xiàn)象。經(jīng)過HPD400樹脂的純化，藍(lán)莓葉多酚的純度由原來的38.75%提高到69.38%。

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道與HPLC-DAD-MS的分析結(jié)果，推測(cè)藍(lán)莓葉中可能含有綠原酸(chlorogenic acid)的兩種同分異構(gòu)體、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸(quercetin-3-O-glucuronide)、3,5-二-反式-咖啡?？鼘幩?3,5-di-Ocaffeoylquinic acid)、3,4-二-反式-咖啡酰奎寧酸(3,4-di-Ocaffeoylquinic acid)、槲皮素(quercetin)。

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