李 玉，路福平，王正祥

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

功能性低聚糖是指含2～10個(gè)單糖分子的糖類物質(zhì)，如低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、殼低聚糖、巖藻糖基化寡糖和唾液酸化寡糖等，它們作為益生元可直接代替蔗糖，作為甜食配料或功能添加劑使用。低聚異麥芽糖、低聚果糖因具有顯著的促雙歧桿菌增殖的作用，已被廣泛應(yīng)用于嬰兒乳粉及食品中；而人乳寡糖(主要是巖藻糖基化寡糖和唾液酸化寡糖)除具有促進(jìn)雙歧桿菌在腸道上皮增殖、定殖的功能外，還具有顯著抑制病原菌黏附，維持嬰兒腸道菌群平衡、參加機(jī)體免疫等功能[1]以及促進(jìn)腦部發(fā)育等生理功能[2]，已逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

低聚異麥芽糖、低聚果糖和人乳寡糖等功能性低聚糖的制備除利用天然產(chǎn)物提取、水解和化學(xué)合成外，還可以通過糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)來高效制備。GTs在天然低聚糖、糖復(fù)合物及其類似物的合成中發(fā)揮著越來越重要的作用[3]。在低聚糖合成中，GTs催化轉(zhuǎn)移的糖分子與受體底物之間形成糖苷鍵，轉(zhuǎn)移的糖分子中尤以單糖分子最為典型[4]；作為糖基供體的既可以是核苷糖，也可以是糖分子；作為受體的一般為糖分子，可以是單糖，也可以是二糖或三糖等。因轉(zhuǎn)移的糖分子數(shù)量不同和受體的結(jié)構(gòu)組成不同，致使形成的低聚糖為不同數(shù)量單糖所組成的混合物。如低聚異麥芽糖、低聚果糖和人乳寡糖，可通過α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、果糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶或唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化作用，分別以葡萄糖(或麥芽糖、麥芽三糖等)、蔗糖或乳糖(或乙酰乳糖)等為糖基的受體進(jìn)行制備，產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量與酶的活性和表達(dá)量、糖基供體的含量、底物的濃度等方面密切相關(guān)。隨著對(duì)這些功能性低聚糖需求的不斷上漲，關(guān)于GTs的來源、基因測(cè)序、高效表達(dá)及應(yīng)用特性方面的研究也日益增多，為進(jìn)一步提高低聚糖的合成效率提供借鑒。

1 α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶

α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosylotransferase，EC3.2.1.20)能切開麥芽糖和麥芽低聚糖分子結(jié)構(gòu)中α-1,6糖苷鍵，并能將游離出來的一個(gè)葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)葡萄糖分子或麥芽糖、麥芽三糖等分子中的α-1,6位上，形成異麥芽糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖、異麥芽五糖和潘糖等，是低聚異麥芽糖制備過程中的關(guān)鍵酶。

1.1 α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物來源

目前研究α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶除少數(shù)來源于植物和動(dòng)物外，絕大多數(shù)均來自于微生物中的細(xì)菌、霉菌及酵母菌，其中產(chǎn)酶較多的是黑曲霉。一些嗜熱微生物如Bacillus stearothermophilus、Clostridium thermohydrosulfuricum、Thermomyces lanuginosus等，也可以產(chǎn)生耐高溫α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[5]。部分α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶見表1。

表1 部分α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌種及活性Table 1 Strains and the activity of α-glycosyl transferase

1.2 α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)

α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶因來源不同，相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、最適作用底物、穩(wěn)定性等也各不相同。α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)分子質(zhì)量一般在40000～150000之間，不同來源的酶相對(duì)分子質(zhì)量差異很大，即使是同一菌屬的不同菌株或同一植物組織中的不同α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)分子質(zhì)量也存在顯著差異。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的pI值都在酸性范圍之內(nèi)，并且變化不大，一般在3.0～5.0之間。多數(shù)α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶具有較高的熱穩(wěn)定性，穩(wěn)定性隨酶分子中疏水氨基酸成分的增加而提高，這可能是由于疏水相互作用的加強(qiáng)導(dǎo)致酶分子的立體結(jié)構(gòu)更加緊密的緣故[6]。

1.3 α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)

從自然界篩選到的微生物一般α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量偏低，雖然誘變育種提高了產(chǎn)量，但產(chǎn)量仍不能適應(yīng)市場(chǎng)的需求。因此，構(gòu)建高產(chǎn)的工程菌株成為改變目前生產(chǎn)現(xiàn)狀的一個(gè)有效途徑。Ogawa等[7]從Aspergillus niger GN-3中克隆出α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，又將該菌株的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因在構(gòu)巢曲霉中進(jìn)行表達(dá)研究。Chen等[8]從黑曲霉中獲得α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，并在畢赤酵母中得到表達(dá)，在3L的發(fā)酵罐中經(jīng)過96h的反應(yīng)，酶活力達(dá)到2.07U/mL，在最適反應(yīng)pH5.0、60℃、反應(yīng)24h條件下，生成的低聚異麥芽糖的含量可達(dá)到26%。Tong等[9]采用Overlap-PCR方法擴(kuò)增得到黑曲霉(NO.SG136)α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，并將其在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，所得酶的最適作用溫度為60℃，最適pH值為4.5，使用pNPG為作用底物時(shí)，酶的Km值和最高作用速率為分別為0.446mmol/L和43.48U/g。本實(shí)驗(yàn)室從黑曲霉中克隆了agA、agB、agC、agD、agE、agF等α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，并實(shí)現(xiàn)了其高效表達(dá)，發(fā)酵酶活力水平可達(dá)65000U/mL。

1.4 α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在低聚異麥芽糖生產(chǎn)中的應(yīng)用

低聚異麥芽糖(isomaltooligosacharide，IMO)指葡萄糖基以α-1,6糖苷鍵結(jié)合而成單糖數(shù)在2～6不等的一類低聚糖，其主要成份為異麥芽糖(isomaltose)、潘糖(panose)、異麥芽三糖(isomaltotriose)及異麥芽四糖等，其中，異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖是體現(xiàn)低聚異麥芽糖功能性主要成分，含葡萄糖和麥芽糖越少，產(chǎn)品純度越高。如Lucía等[10]利用來自Xanthophyllomyces dendrorhous的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，以200g/L的麥芽糖為底物可以獲得53.8g/L的IMO。Duan等[11]利用炭黑曲霉的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，以300g/L的麥芽糖為底物在最適條件下可獲得55%的IMO產(chǎn)率。Wang等[12]通過PCR獲得α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因片段，在大腸桿菌中表達(dá)出的重組酶可以將底物為400g/L的麥芽糖轉(zhuǎn)化成低聚異麥芽糖，其轉(zhuǎn)化率為52%，產(chǎn)品中的83%是由異麥芽糖、異麥芽三糖和潘糖組成的。本實(shí)驗(yàn)室利用工程菌株所產(chǎn)的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，在pH5.0、溫度50℃、麥芽糖漿含量為30%左右時(shí)，作用28～30h可獲得潘糖含量35%～40%、異麥芽糖含量20%～25%、葡萄糖含量20%～25%的IMO，進(jìn)一步用活性干酵母0.1%～0.2%作用6～8h后，可獲得潘糖含量高于45%，IMO純度達(dá)98%以上的高品質(zhì)產(chǎn)物。

目前由于α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的市場(chǎng)價(jià)格一直較高，為了提高酶的利用率，采用固定化酶或固定化細(xì)胞技術(shù)可提高酶的循環(huán)使用次數(shù)。如利用殼聚糖固定化α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和以聚乙烯醇(PVA)復(fù)合凝膠固定化產(chǎn)α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的黑曲霉細(xì)胞，都可提高酶的利用效率，改善細(xì)胞的機(jī)械性能和化學(xué)穩(wěn)定性。如Sheu等[13]將α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶固定化在戊二醛-殼聚糖反應(yīng)器中，用30g/100mL的麥芽糖溶液生產(chǎn)低聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%。不使用固定反應(yīng)器，通過菌絲來產(chǎn)α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，30g/100mL的麥芽糖溶液只能產(chǎn)生46%的低聚糖。Zhang等[14]通過將α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶固定化在一個(gè)聚合物-無機(jī)物混合的膠囊盒中(海藻酸、殼聚糖、磷酸鈣)，在最適條件下，循環(huán)使用15次后仍然可以保持初酶活力的65%。在4℃條件下，保存30d后，非固定化酶的酶活力只有初酶活力的35%，而固定化的酶活力則仍有85%。因而固定化膠囊盒的使用可以有效地提高α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的循環(huán)性和穩(wěn)定性。

2 果糖基轉(zhuǎn)移酶

低聚果糖(fructooligosaccharides，F(xiàn)OS)又名蔗果低聚糖、寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，是指在果糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，通過轉(zhuǎn)移果糖基作用所形成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)的混合物。果糖基轉(zhuǎn)移酶(fructosyltransferase，EC 2.4.1.9)主要以蔗糖為底物，轉(zhuǎn)移果糖基至蔗糖分子上合成FOS。

2.1 果糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物來源

果糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物來源十分廣泛，廣泛存在于真菌和細(xì)菌中，如表2所示。其中真菌來源主要有：日本曲霉(Aspergillus japonicus)、紅酵母(Rhodotorula sp.)、青霉菌(Penicillium expansum)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，細(xì)菌主要有運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、軟化芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)、節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)等[15-16]。

表2 果糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物來源[15-16]Table 2 Strains and the activity of fructosyltransferase[15-16]

2.2 果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)

一般果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適pH值范圍為5.0～6.5，最適溫度范圍為50～60℃，少數(shù)會(huì)在40℃或高達(dá)70℃，以蔗糖為底物的Km值多在0.29～0.82mol/L范圍內(nèi)。培養(yǎng)基組成成分，特別是碳源，對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)具有較大的影響[17-18]。真菌來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶為2～6個(gè)單元組成的多聚體，相對(duì)分子質(zhì)量在180000～600000之間，細(xì)菌來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶多為單體，相對(duì)分子質(zhì)量為50000～90000。關(guān)于激活劑和抑制劑報(bào)道不多，Ca2＋、Mg2＋、Co2＋和Li＋等對(duì)酶有激活作用，Pb2＋、Hg2＋和Ag＋具有強(qiáng)抑制效應(yīng)[19]。果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化機(jī)理根據(jù)酶的來源和純度不同而不同，目前大部分研究者接受的理論是：果糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖合成FOS的反應(yīng)是歧化反應(yīng)，其中一個(gè)蔗糖分子作為果糖基的供體，另一個(gè)蔗糖分子作為受體，在酶的作用下，果糖基與酶結(jié)合，形成1分子葡萄糖和1分子的果糖基與酶結(jié)合的中間產(chǎn)物，如方程式(1)，然后中間產(chǎn)物與果糖基受體結(jié)合，形成FOS，果糖基轉(zhuǎn)移酶脫落下來參與下一個(gè)新的循環(huán)[20-22]。反應(yīng)原理如方程式(2)和圖1所示。

圖 1 果糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)機(jī)理[23]Fig.1 Reaction mechanism of fructosyltransferase[23]

2.3 果糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)

產(chǎn)高酶活力的果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株是FOS生產(chǎn)的關(guān)鍵，除利用傳統(tǒng)的誘變技術(shù)選育產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株外，利用基因工程改造菌株也是提高其酶活力的一種重要方法。Heyer等[24]對(duì)來源于Aspergillus sydowi的果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了研究，該酶與來源于Aspergillus niger的酶同源，在分生孢子里面表達(dá)，菌體里面無表達(dá)，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量75kD，并對(duì)其在Escherichia coli、Saccharomyces cerevisae和Solanum tuberosum中進(jìn)行了表達(dá)研究，表達(dá)的酶蛋白可分泌到菌體外。Trujillo等[25]報(bào)告了果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在Pichia pastoris中的克隆與表達(dá)，在酵母工程菌的胞內(nèi)和胞外均檢測(cè)到了酶活力，其中81%的酶活力(3500U/L)存在周質(zhì)空間中，利用該酶可將蔗糖底物的70%轉(zhuǎn)化蔗果三糖。

2.4 果糖基轉(zhuǎn)移酶在FOS生產(chǎn)中的應(yīng)用

果糖基轉(zhuǎn)移酶在FOS生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用，一般采用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶或者固定化產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞進(jìn)行FOS的生產(chǎn)。Mussatto等[26]采用植物纖維固定化Aspergillus japonicus ATCC 20236細(xì)胞進(jìn)行果糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)，連續(xù)反應(yīng)8個(gè)循環(huán)，酶活力下降了22%；Lin等[27]采用海藻酸鈣固定化Aspergillus japonicus和Aspergillus niger細(xì)胞生產(chǎn)高純度FOS，得到了質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%的高純度FOS；Jung等[28]采用海藻酸鈣固定化Aureobasidium pullulans細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)FOS，反應(yīng)100d后再補(bǔ)充固定化細(xì)胞；馬玉紅等[29]利用陰離子交換樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)行FOS生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了大量的利用固定化酶和固定化細(xì)胞進(jìn)行FOS生產(chǎn)的相關(guān)研究，包括利用樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶和利用卡拉膠固定化黑曲霉細(xì)胞及其相關(guān)研究，確定了固定化細(xì)胞生產(chǎn)FOS的生產(chǎn)工藝[30]。

3 巖藻糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶

人乳寡糖中的中性寡糖約占90%，以巖藻糖基化寡糖為主，其中α-1,2-巖藻糖基化寡糖占73%左右。此外，酸性寡糖(唾液酸化寡糖)含量為10%。巖藻糖基化寡糖和唾液酸化寡糖的合成均以核苷糖為糖基供體，以乳糖或乙酰乳糖為受體，在巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化條件下完成。

3.1 巖藻糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶微生物來源

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase，EC 2.4.1.69)是一類催化巖藻糖基由GDP-巖藻糖(GDP-fucose)轉(zhuǎn)移到N-連接型糖鏈核心結(jié)構(gòu)的酶。微生物來源的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶來源于幽門螺桿菌(Helicobactoer pylori)、大腸桿菌菌株(Escherichia coli O127：K63(B8)、O128、O86)、雪貂螺桿菌(Helicobacter mustelae)等菌株[31-35]。唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶(sialyltransferase，EC2.4.99.X)主要是以胞苷一磷酸-β-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-β-N-acetylneuramic acid，CMP-Neu5Ac)為底物將唾液酸殘基轉(zhuǎn)移至新的糖基受體上形成唾液酸糖苷化合物。微生物來源主要為一些病原菌，包括Escherichia coli K1、發(fā)光弧菌(Vibrionaceae photobacterium sp.)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)等[36-38]。

3.2 巖藻糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)

幽門螺桿菌來源α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,2-FucT)具有廣泛的底物特異性，不需要金屬離子作為輔因子，最適pH5.0，在pH4.0～8.0之間有活性。致腸病Escherichia coli菌株O128來源的α-1,2-FucT具有廣泛的底物特異性，乳果糖作為受體表現(xiàn)出最高的活性[33]。Escherichia coli菌株O86來源的α-1,2-FucT表現(xiàn)出嚴(yán)格的底物特異性，僅能利用T抗原(Gal-β-l,3-GalNAc-α-O-Bn/Me)作為受體底物[34]。Escherichia coli O127：K63(B8)來源的α-1,2-FucT屬于GTB超家族，不需要金屬離子實(shí)現(xiàn)催化，最合適的pH值是6.5和7.5，其底物特異性很嚴(yán)格，僅能識(shí)別非還原端Gal-β-1,3-GalNAc的受體，而不能識(shí)別還原端為其他的Gal-β受體[35]。研究表明，與哺乳動(dòng)物來源的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶相比，微生物來源的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶具有更寬廣的底物來源。如來源于淋病奈瑟氏菌α-2,3-唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶，乳糖及其類似物都可以作為其合成的底物。來源于美人魚發(fā)光桿菌的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶，Gal-α/β-O-Me、GalNAc-α-O-Me、LacNAc-β-O-Me和乳糖是較好的作用底物。雖然唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶具有廣泛的底物特異性，但轉(zhuǎn)糖基的效率因唾液酸糖基與受體的連接方式不同而有所差異，如來源于腦膜炎球菌的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)移到半乳糖的β-1,4位點(diǎn)是半乳糖的β-1,3位點(diǎn)的10倍左右[39]。

3.3 巖藻糖基和唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)

哲名家等[40]從兔肌肉組織中抽提基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增出FUT2基因，然后將該基因亞克隆入原核表達(dá)載體pET30a-FuT2中，成功克隆了兔巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，獲得了分子質(zhì)量約為45kD的FUT2蛋白。李樹芳[41]利用一種雪貂螺桿菌(Helicobacter mustelae)來源的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，通過構(gòu)建不同的表達(dá)載體，最終通過融合谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，提高了雪貂螺桿菌來源的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在Escherichia coli BL21(DE3)可溶性的表達(dá)，1L菌體共獲得重組融合蛋白為2mg，其產(chǎn)物通過BiO-Gel P-2純化，得到1mg的產(chǎn)物三糖。本實(shí)驗(yàn)室利用PCR方法從幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori HP1)基因組DNA中獲得α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(α-1,2-fucosyltransferase，α-1,2-FucT)，得到大小為906bp的目的基因，將其定向插入到原核表達(dá)載體pET-22b(+)中，得到重組表達(dá)載體pET-FucT。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，25℃、0.1mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)4h，SDS-PAGE分析可表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量為33000的蛋白，與預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量一致，HPLC法對(duì)產(chǎn)物檢驗(yàn)結(jié)果表明α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌BL21中的活性表達(dá)[42-43]。

3.4 巖藻糖基和唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶在乳寡糖合成中的應(yīng)用

利用巖藻糖基和唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用可以體外合成人乳寡糖及其類似物。如Byun等[44]以巖藻糖為底物合成GDP-巖藻糖，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，使GMD和WcaG酶得到高效表達(dá)，在25℃條件下得到(38.9±0.6)mg/L的GDP-巖藻糖，為進(jìn)一步合成巖藻糖基化寡糖提供了條件。Koizumi等[45]利用重組大腸桿菌耦合發(fā)酵，以GMP、甘露糖、乙酰半乳糖胺為底物，產(chǎn)氨棒桿菌提供能量發(fā)酵30h，巖藻糖基化低聚糖的最大合成量為40mmol/L(21g/L)。

Endo等[46]通過將CMP-NeuAC生產(chǎn)系統(tǒng)與過量表達(dá)α-2,3唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)相結(jié)合，可得到33g/L的3-唾液酸乳糖。Fierfort等[47]通過在大腸桿菌體內(nèi)引入合成CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的基因，后續(xù)高效表達(dá)來源于腦膜炎奈瑟氏菌的α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因，唾液酸化乳糖的含量可達(dá)到25g/L。Drouillard等[38]利用大腸桿菌高效表達(dá)來源于發(fā)光桿菌(Photobacterium sp. JT-ISH-224)的α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因，唾液酸化乳糖的含量可達(dá)到30g/L。

4 結(jié) 語

隨著人們健康意識(shí)的逐步提高，對(duì)功能性低聚糖的需求量越來越大，但利用微生物來源的糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成功能性低聚糖還存在很多問題，如利用α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，以淀粉為原料合成低聚異麥芽糖的生產(chǎn)成本過高、不能實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，目前用于低聚異麥芽糖的生產(chǎn)的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶大多為進(jìn)口產(chǎn)品，如何得到高轉(zhuǎn)化率的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來提高低聚異麥芽糖的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，是需要解決的關(guān)鍵問題；利用果糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成低聚果糖的生產(chǎn)成本較高，提取工藝較復(fù)雜，純度較低，只能達(dá)到40%～50%，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上高純度的低聚果糖基本上是從國(guó)外進(jìn)口，因此果糖基轉(zhuǎn)移酶的高產(chǎn)菌株的獲得、固定化技術(shù)及生產(chǎn)工藝、高純度低聚果糖提取等方面將是低聚果糖生產(chǎn)的關(guān)鍵；利用微生物合成巖藻糖基化及唾液酸化寡糖等人乳寡糖的技術(shù)還不成熟，前體物核苷糖的價(jià)格昂貴、合成效率低，因此如何解決核苷糖的有效合成及糖基轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，在人乳寡糖及其類似物的合成中具有重要的科研價(jià)值和研究意義。

另外，以酶促催化合成為基礎(chǔ)的新型糖品的研究與開發(fā)為人們所期待。因此，可以預(yù)見，隨著多種新型酶分子的發(fā)現(xiàn)和商業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用成為可能，更多優(yōu)質(zhì)新型糖品將會(huì)被逐漸發(fā)現(xiàn)和研制。除了本文描述的幾種糖基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)用于功效糖品的制備外，還有多種糖酶也極具應(yīng)用價(jià)值，如具有轉(zhuǎn)苷活性的β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-木糖苷酶等，可應(yīng)用于寡聚半乳糖、龍膽二糖、水蘇糖、寡聚木糖等的研制與生產(chǎn)。

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