劉 猛，杜 明*，孔瑩瑩，徐偉麗，宋 微，張?zhí)m威

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090)

乳鐵蛋白(Lf)又稱乳鐵傳遞蛋白，主要存在于哺乳動(dòng)物的各種外分泌物中，如乳汁、淚液或唾液等[1]。Lf可以作為一種鐵強(qiáng)化劑調(diào)控鐵的生物利用率，此外，Lf還具有多種其他生物功能，例如抗菌、抗病毒和抗氧化作用，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力[2]等。近期，乳鐵蛋白被發(fā)現(xiàn)具有促骨生長的功效[3-4]。諸多研究表明，Lf既能刺激成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化、也能抑制破骨細(xì)胞生長與活性、誘導(dǎo)破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)凋亡[5-6]。體內(nèi)研究表明，乳鐵蛋白在骨生長和代謝中起到一定的生理作用，能促進(jìn)骨骼生長[7]。在乳品加工業(yè)中，熱處理是最為常見的操作單元，然而迄今為止，熱處理對乳鐵蛋白活性的影響研究主要集中在抗菌活性等方面。熱處理對乳鐵蛋白成骨作用的影響報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)主要研究熱處理(溫度和時(shí)間)對乳鐵蛋白成骨活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

SD大鼠乳鼠(72h以內(nèi))由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。

乳鐵蛋白(＞94%)、Ⅱ型膠原酶、MTT 美國Sigma公司；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國Hyclone公司；胰蛋白酶-EDTA消化液 Solarbio公司；二甲基亞砜(DMSO)、巴比妥鈉 美國Gibco公司。

倒置式生物顯微鏡 日本Nikon公司；Eon型酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；HEPA class 100型細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞分離鑒定

從新生SD大鼠乳鼠中提取成骨細(xì)胞，通過形態(tài)觀察、HE 染色、堿性磷酸酶染色及礦化結(jié)節(jié)染色來鑒定成骨細(xì)胞[8]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及熱處理

樣品分組：Lf低質(zhì)量濃度組(50μg/mL)、中質(zhì)量濃度組(100μg/mL)、高質(zhì)量濃度組(500μg/mL)。熱處理?xiàng)l件：62～65℃處理 30min、72℃處理 10s、85℃處理10min以及95℃處理10min。以未經(jīng)加熱的乳鐵蛋白(Native-Lf)為對照。

1.2.3 MTT法測定成骨細(xì)胞增殖

調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)量濃度為每孔l×105個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，每孔再加入95μL培養(yǎng)液以及5μL樣品溶液。測定前4h，加10μL 0.5mg/mL MTT(pH7.2 0.01mol/L PBS配制)，培養(yǎng)箱中孵育4h。棄去培養(yǎng)液，每孔加150μL DMSO，振蕩10min使結(jié)晶溶解。波長490nm 處測定OD490nm[9]。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖

數(shù)據(jù)采用 Origin8.0軟件進(jìn)行計(jì)算繪圖。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，One-way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 成骨細(xì)胞的鑒定

圖 1 SD大鼠乳鼠成骨細(xì)胞分離與鑒定Fig.1 Isolation and identifi cation of osteoblasts from newborn SD rats

倒置顯微鏡觀察成骨細(xì)胞，以不規(guī)則形、長梭形、三角形為主，相鄰細(xì)胞彼此貼靠，邊界難以分清，結(jié)果如圖1a所示，HE染色、堿性磷酸酶染色、礦化結(jié)節(jié)染色分別如圖1b～d所示，這些染色結(jié)果均表明分離的細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的所有特征[8]。

2.2 Native-Lf對成骨細(xì)胞增殖的影響

圖 2 未經(jīng)過熱處理的Lf對成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用Fig.2 Osteoblast-promoting activity of lactoferrin without heat treatment

Native-Lf對成骨細(xì)胞增殖作用影響如圖2所示，Native-Lf低質(zhì)量濃度組(50μg/mL)在24、48、72h對成骨細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用；中質(zhì)量濃度組(100μg/mL)作用細(xì)胞24h能顯著性促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，48h和72h能極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖；高質(zhì)量濃度組(500μg/mL)在24h和48h能極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，在72h時(shí)顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，Native-Lf對成骨細(xì)胞增殖作用呈劑量依賴關(guān)系，這與文獻(xiàn)[5,10]報(bào)道具有一致性。但24～72h不同時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出的趨勢略有不同，24h條件下，高質(zhì)量濃度 Native-Lf活性最高，與中質(zhì)量濃度和低質(zhì)量濃度組差異顯著；48h中質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度組Native-Lf活性顯著高于低質(zhì)量濃度組；72h條件下，中質(zhì)量濃度的活性顯著高于低質(zhì)量濃度組和高質(zhì)量濃度組。整體上看，隨著作用時(shí)間的延長，Native-Lf的最佳作用質(zhì)量濃度有一定的下降趨勢。

2.3 不同溫度熱處理對乳鐵蛋白成骨細(xì)胞增殖的影響

2.3.1 65℃加熱處理Lf對成骨細(xì)胞增殖作用影響

Lf經(jīng)過65℃加熱處理30min，對成骨細(xì)胞作用結(jié)果如圖3所示。24h，質(zhì)量濃度在50～500μg/mL時(shí)能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖；48h和72h，低質(zhì)量濃度組可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，在Lf為100μg/mL時(shí)能極顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。高質(zhì)量濃度組在48h和72h相對于對照組，有少量增加，但差異不顯著。這些結(jié)果說明65℃/30min對Lf的活性影響在50～100μg/mL范圍內(nèi)幾乎無顯著影響，對于高質(zhì)量濃度組有一定的影響。研究表明，這4種加熱參數(shù)對于乳鐵蛋白熱聚集的誘導(dǎo)作用是不同的，隨著加熱強(qiáng)度的提高，乳鐵蛋白的熱聚集作用增強(qiáng)。高質(zhì)量濃度時(shí)，Lf熱聚集的趨勢相應(yīng)增強(qiáng)，相應(yīng)地Lf的生理活性受影響也較為明顯。

圖 3 65℃/30min處理的Lf對成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of 65 ℃/30 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

2.3.2 72℃加熱處理Lf對成骨細(xì)胞增殖作用影響

圖 4 72 ℃/10s處理LF對成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of 72 ℃/10 s on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

Lf經(jīng)72℃加熱處理10s，對成骨細(xì)胞增殖作用結(jié)果如圖4所示。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)條件下，各質(zhì)量濃度組均可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，而且低質(zhì)量濃度組(50μg/mL)顯著高于中質(zhì)量濃度組(100μg/mL)和高質(zhì)量濃度組(500μg/mL)。整體趨勢與未經(jīng)加熱處理的Lf相差不大，這說明72℃/10s對Lf的活性影響相對較小，尤其對于質(zhì)量濃度較低的情況影響較小。

2.3.3 85℃加熱處理Lf對成骨細(xì)胞增殖作用影響

Lf經(jīng)85℃加熱處理10min，對成骨細(xì)胞增殖作用如圖 5所示。24h時(shí)，低質(zhì)量濃度組可極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，中質(zhì)量濃度組與對照組差異顯著，高質(zhì)量濃度組則極顯著抑制細(xì)胞增殖；48h時(shí)，Lf在中低質(zhì)量濃度時(shí)與對照組差異不顯著，在高質(zhì)量濃度時(shí)則極顯著抑制成骨細(xì)胞增殖；72h，低質(zhì)量濃度組可極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，中質(zhì)量濃度組時(shí)與對照組相比無顯著差異，高質(zhì)量濃度組則顯著性抑制成骨細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，85℃/10min對Lf活性影響較大，整體上呈下降趨勢，在高質(zhì)量濃度組影響較大。而且在不同時(shí)間點(diǎn)，活性表現(xiàn)不同，分析可能是由于Lf對調(diào)控成骨細(xì)胞增殖的信號(hào)通路調(diào)控作用不同造成的[11-12]。

成骨細(xì)胞的生長分化主要由以絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)。主要包括ERK、JNK 和p38MAPK 3個(gè)亞通路。有研究報(bào)導(dǎo)了Lf調(diào)控成骨細(xì)胞p42/44MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖，并明顯地抑制成骨細(xì)胞凋亡[12]。因此，有本研究結(jié)果推測，Lf對這些信號(hào)通路的調(diào)控可能發(fā)生在不同的階段，由此造成了上述現(xiàn)象。

圖 5 85℃/10min處理Lf對成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of 85 ℃/10 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

2.3.4 95℃加熱處理Lf對成骨細(xì)胞增殖作用影響

圖 6 95℃/10min處理Lf對成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of 95 ℃/10 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

Lf經(jīng)95℃加熱處理10min，對成骨細(xì)胞增殖作用如圖6所示。24h時(shí)，低、中質(zhì)量濃度組的Lf可顯著性促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，高質(zhì)量濃度組(500μg/mL)則極顯著性抑制成骨細(xì)胞增殖；48h與72h時(shí)，中低質(zhì)量濃度組與對照組無顯著差異，高質(zhì)量濃度組顯著性抑制成骨細(xì)胞增殖；這說明95℃加熱處理10min對乳鐵蛋白的活性具有明顯影響，趨勢與85℃/10min處理組相似。

Rüegg等[13]研究發(fā)現(xiàn)在pH值為6.6時(shí)，Lf在65～69℃時(shí)開始失活。研究發(fā)現(xiàn)Lf的Tm隨pH值減小而降低，當(dāng)體系pH值由7.0降至3.0時(shí)，牛乳乳鐵蛋白(bLf)的Tm由70℃變化為39℃，且bLf的變性是不可逆的。程金波等[14]研究發(fā)現(xiàn)不同的溫度與時(shí)間的熱處理方式組合可以顯著的影響乳中Lf的活性。有研究表明，巴氏殺菌對bLf結(jié)構(gòu)及抗菌活性基本上沒影響[15]。另外，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能。Lf發(fā)揮功能過程中可能以骨橋蛋白(OPN)作為運(yùn)轉(zhuǎn)載體[16-17]，并主要通過LRP1/2介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入成骨細(xì)胞[18]，這些蛋白間的相互作用也隨著Lf結(jié)構(gòu)的變化而變化。本小組此前的研究報(bào)道了Native-Lf的變性溫度為73.1℃，當(dāng)處理溫度大于73.1℃時(shí)，Lf發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，與OPN和LRP1等的相互作用也將發(fā)生改變，活性也將受到影響。因此本研究中65℃/30min和72℃/10s對Lf活性影響較小，85℃/10min和95℃/10min對Lf活性的影響較大，這些熱處理對Lf促成骨活性的影響程度從小到大的順序?yàn)?2℃/10s＜65℃/30min＜85℃/10min＜ 95℃/10min。

3 結(jié) 論

未經(jīng)加熱處理的乳鐵蛋白具有良好的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖活性，在50～500μg/mL可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。一定強(qiáng)度的熱處理將破壞乳鐵蛋白的促成骨活性，隨著熱處理強(qiáng)度的提高，該活性損失程度逐漸增加。65℃/30min和72℃ 10s對Lf的活性無顯著影響，85℃/10min和95℃/10min對Lf成骨活性影響顯著，尤其是對高質(zhì)量濃度的劑量組。不同時(shí)間點(diǎn)，Lf對成骨細(xì)胞增殖活性的影響表現(xiàn)不同。

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