張永勤，張 杰，常海燕，張 坤，劉征東，羅彩華，牟曉鳳

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

近年來，隨著低聚殼聚糖以及殼寡糖在醫(yī)藥、生物材料、生物能源、食品工業(yè)、化妝品以及環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域的不斷應(yīng)用，殼聚糖水解酶已成為國內(nèi)外諸多學(xué)者的研究熱點(diǎn)[1-5]。在殼聚糖的水解工藝中，與傳統(tǒng)化學(xué)水解法相比，酶解法更易控制，底物特異性強(qiáng)，副產(chǎn)物少。但是，由于殼聚糖酶的活力測(cè)定方法普遍具有較低的靈敏度，一方面影響了殼聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選進(jìn)程，致使殼聚糖酶的價(jià)格居高不下[6]，另一方面也限制了殼聚糖酶在應(yīng)用過程中的質(zhì)量控制。酶活力是衡量水解酶性能的關(guān)鍵指標(biāo)，酶活力測(cè)定方法的研究，能夠?yàn)闅ぞ厶撬饷冈诤Y選、生產(chǎn)和應(yīng)用過程中提供有效的質(zhì)量控制手段。因此，尋求一種有效的殼聚糖水解酶活力測(cè)定方法對(duì)于殼聚糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分重要。目前常用Somogyi-Nelson法[7]、3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[8]、鐵氰化鉀法[9]和BCA法[10-11]測(cè)定多糖水解酶活力，但由于這些方法或多或少存在靈敏度、測(cè)定范圍、試劑高毒性、蛋白質(zhì)影響等問題導(dǎo)致了其在多糖水解酶活力測(cè)定的應(yīng)用上受到不同程度的限制[12]。

本實(shí)驗(yàn)將3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH)高靈敏度測(cè)定還原糖含量的方法[13-14]應(yīng)用到殼聚糖酶的活力測(cè)定中，以高脫乙酰殼聚糖為酶解底物，并針對(duì)殼聚糖本身的物化特性設(shè)計(jì)并優(yōu)化活力測(cè)定方法。近年來有學(xué)者報(bào)道了果膠酶[15]、木瓜蛋白酶[16]、蛋白酶[17]、溶菌酶[18]以及纖維素酶[6,19-20]等都具有殼聚糖水解酶活力，特別是纖維素酶具有的殼聚糖水解酶活力較高[21]?？紤]到殼聚糖酶的純酶制劑價(jià)格昂貴，因此，本研究以含有殼聚糖酶活力的纖維素酶制劑為實(shí)驗(yàn)材料，利用MBTH法測(cè)定其所含有的微量殼聚糖水解酶活力，并與目前最常采用的DNS法和鐵氰化鉀法做對(duì)比，以期對(duì)殼聚糖酶的定量、篩選與應(yīng)用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

纖維素酶(ROCKSOFTTM ACE P150) 日本Dyadic公司；殼聚糖(93.5%脫乙酰度，1H NMR) 實(shí)驗(yàn)室自制；氨基葡萄糖、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH)、二硫蘇糖醇(DTT) 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

SHZ-82恒溫水浴振蕩器 常州智博瑞儀器制造有限公司；UNICO-2100紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼科(上海)儀器有限公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；移液器 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖溶液的配制

稱取2.000g殼聚糖于500mL燒杯內(nèi)，逐滴加入10mL 0.2mol/L醋酸溶液，攪拌至殼聚糖完全溶解，且體系呈透明凝膠狀，在4℃冰箱靜置2h。加入適量0.2mol/L醋酸鈉溶液，攪拌至膠狀體系溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.0，適當(dāng)時(shí)可加微量10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值。將溶液轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶?jī)?nèi)，用0.2mol/L、pH6.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容至500mL，充分混勻。配制成4mg/mL的殼聚糖溶液于4℃冰箱內(nèi)貯藏備用。整個(gè)酶解體系使用0.2mol/mL、pH6.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液為溶劑，以下同。

1.2.2 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

MBTH法：用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液分別配制終質(zhì)量濃度為0～80μg/mL的氨基葡萄糖溶液(每個(gè)稀釋度各含有2mg/mL殼聚糖底物)，取2mL該溶液與2mL 0.5mol/L氫氧化鈉溶液充分混勻，8000r/min離心5min，取1mL上清液與0.5mL MBTH試劑充分混勻，于80℃水浴15min，迅速加入1mL硫酸鐵銨試劑(0.5g/100mL (FeNH4(SO4)2)·12H2O、0.5%氨基磺酸、0.5mol/L鹽酸)，混勻，于655nm波長處測(cè)定吸光度，每組3個(gè)平行樣。

DNS法：參照Miller[8]的方法，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)殼聚糖酶活力測(cè)定方法的特點(diǎn)稍加修改。用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制終質(zhì)量濃度為0～1.5mg/mL的氨基葡萄糖溶液(每個(gè)稀釋度各含有2mg/mL殼聚糖底物)。取2mL還原糖溶液與0.2mL 10mol/L氫氧化鈉溶液充分混勻，8000r/min離心5min，取0.4mL上清液向其中加入0.3mL DNS試劑，沸水浴15min，迅速冷卻，加入4.3mL蒸餾水中，充分混勻，于500nm波長處測(cè)定吸光度值，每組3個(gè)平行樣。

鐵氰化鉀法：參照文獻(xiàn)[9]的方法，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)殼聚糖酶活力測(cè)定方法的特點(diǎn)稍加修改。用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制終質(zhì)量濃度為0～100μg/mL的氨基葡萄糖溶液(每個(gè)稀釋度各含有2mg/mL的殼聚糖底物)。取4mL還原糖溶液加入0.4mL 10mol/L氫氧化鈉溶液，充分混勻，8000r/min離心5min，取1.2mL上清液與1.6mL鐵氰化鉀試劑充分混勻，沸水浴15min，迅速冷卻，于420nm波長處測(cè)定吸光度，每組3個(gè)平行樣。

1.2.3 酶活力測(cè)定方法

多點(diǎn)法(罐法、動(dòng)力學(xué)法、動(dòng)態(tài)法)：在錐形瓶中將已預(yù)熱的底物溶液與酶溶液迅速充分混勻(MBTH：19.8mL底物＋0.2mL酶溶液，DNS：10mL底物＋10mL酶溶液，鐵氰化鉀：36.4mL底物＋0.4mL酶溶液；底物終質(zhì)量濃度均為2mg/mL)，在37℃條件下水浴加熱，分別在0、10、20、30、40、50、60min時(shí)取酶解液與氫氧化鈉充分混合終止反應(yīng)(MBTH：2mL酶解液＋2mL 0.5mol/L氫氧化鈉，DNS：2mL酶解液＋0.2mL 10mol/L氫氧化鈉，鐵氰化鉀法：4mL酶解液＋0.4mL 10mol/L氫氧化鈉)，8000r/min離心15min，取上清液，按照1.2.2節(jié)中的方法測(cè)定酶解液中還原糖含量，每組做3個(gè)平行樣。

終點(diǎn)法(試管法)：在試管中將已預(yù)熱的1mL 4mg/mL底物溶液與1mL酶溶液充分混勻(底物終質(zhì)量濃度為2mg/mL)，在37℃條件下水浴加熱反應(yīng)1h，加入氫氧化鈉終止反應(yīng)(各方法中氫氧化鈉濃度與比例同上)，8000r/min離心15min，取上清，按照1.2.2節(jié)中的方法測(cè)定酶解液中還原糖含量，每組做3個(gè)平行樣。

酶活力單位(1U)定義：在上述MBTH法的反應(yīng)條件下，使每毫升酶解液每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol氨基葡萄糖的還原糖的量所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。檢測(cè)限(DL)和定量限(QL)根據(jù)公式(1)和(2)[22]計(jì)算所得。

式中：Sbi是9個(gè)空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差；b為回歸方程的斜率。

1.2.4 酶動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定方法

將纖維素酶溶液與殼聚糖底物溶液按一定比例混合，在37℃條件下水浴加熱，分別在0、10、20、30、40、50、60min時(shí)終止反應(yīng)，酶解液在8000r/min條件下離心15min，按照1.2.2節(jié)的方法測(cè)定還原糖含量，每個(gè)樣品組做3個(gè)平行樣。

1.2.5 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶活力測(cè)定的影響

分別配制質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.80mg/mL的殼聚糖底物溶液，取0.2mL酶溶液與19.8mL底物溶液在試管(100mm×15mm)中混合，在37℃條件下水浴加熱，分別于0、10、20、30、40、50、60min時(shí)終止反應(yīng)。取酶解液在8000r/min條件下離心15min，按照1.2.2節(jié)的方法測(cè)定還原糖含量，每個(gè)樣品組做3個(gè)平行樣。

1.2.6 酶質(zhì)量濃度曲線的繪制

按照1.2.3節(jié)的多點(diǎn)測(cè)定法進(jìn)行酶活力測(cè)定，其中纖維素酶溶液用0.2mol/L、pH6.0醋酸-醋酸鈉溶液配制， 并相應(yīng)稀釋8個(gè)質(zhì)量濃度梯度，使酶解液中纖維素酶濃度分別為0～150μg/mL(MBTH法)、0～1.2mg/mL(DNS法)、 0～100μg/mL(鐵氰化鉀法)。檢測(cè)限和定量限參照1.2.3節(jié)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 MBTH法測(cè)定氨基葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其比較

圖 1 3種方法測(cè)定氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(MBTH、鐵氰化鉀、DNS)Fig.1 Standard curves of glucosamine for the three method, MBTH, Schales’ Procedure and DNS methods

由圖1可知，在測(cè)定氨基葡萄糖濃度時(shí)，MBTH法靈敏度最高，其檢測(cè)限為4.5μmol/mL，而DNS法和鐵氰化鉀法分別為320μmol/mL和8.0μmol/mL。在DNS法中，氨基葡萄糖濃度較低時(shí)，無法檢測(cè)出溶液中的還原糖含量，從而導(dǎo)致其標(biāo)準(zhǔn)曲線很難過原點(diǎn)[7-8]，而在3.8mmol/mL以上的濃度點(diǎn)回歸而成的標(biāo)準(zhǔn)曲線更接近原點(diǎn)，如圖1中的嵌入圖所示。鐵氰化鉀法屬減色法，空白的吸光度決定著該方法的檢測(cè)范圍，其空白值的測(cè)定誤差也決定著還原糖的檢測(cè)限。當(dāng)還原糖濃度超過340μmol/mL時(shí)，隨著還原糖濃度的增高吸光度呈非線性變化，超出了該法的檢測(cè)范圍，即樣品吸光度趨向零，無法測(cè)出還原糖含量，從而導(dǎo)致該法工作濃度范圍過于狹窄。相比之下，MBTH法避開了上述缺點(diǎn)，其靈敏度是鐵氰化鉀法的1.8倍，DNS法的71倍，具有較寬的檢測(cè)范圍，特別適合于微量還原糖濃度的測(cè)定。

2.2 酶活力測(cè)定方法的建立及底物質(zhì)量濃度對(duì)酶活力測(cè)定的影響

考慮到本實(shí)驗(yàn)所使用的纖維素酶在pH6.0(最適pH值)和55℃(最適溫度)條件下預(yù)熱15min，其酶活力即損失50%[23]；殼聚糖在較高溫度條件下會(huì)發(fā)生非酶降解；過低的酶解溫度難以在一般實(shí)驗(yàn)室溫度條件下得以控制，因此，本實(shí)驗(yàn)將酶解溫度設(shè)定在37℃。由于殼聚糖不溶于堿性環(huán)境，當(dāng)加入NaOH終止反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量沉淀，需在離心后取上清液進(jìn)行還原端基濃度的測(cè)定。在理論上，酶解反應(yīng)中底物質(zhì)量濃度越高，酶解反應(yīng)速率越能維持在最大值。但是，由于過高的底物濃度具有較高黏度而影響酶解進(jìn)程(傳質(zhì)速率較慢)；在酶解終止后會(huì)產(chǎn)生大量沉淀而減少上清液體積；會(huì)使底物本身的還原基團(tuán)濃度增加而導(dǎo)致本底值(即空白值)增加；且會(huì)增加測(cè)定成本等，因此，選擇合適的底物濃度有助于該酶活力的準(zhǔn)確測(cè)定。

圖 2 不同底物質(zhì)量濃度條件下MBTH法動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curves of various substrate concentrations for MBTH method

圖2為在不同殼聚糖底物質(zhì)量濃度條件下的酶解進(jìn)程曲線。在該圖中，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度在0.05、0.10mg/mL時(shí)，酶解反應(yīng)速率分別在20、30min內(nèi)保持恒定，隨后酶解反應(yīng)速率逐漸降低，即產(chǎn)物生成量與酶解時(shí)間呈非線性關(guān)系，這可能是因?yàn)殡S著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，底物殼聚糖被不斷消耗而釋放出還原端基，使酶不再與底物達(dá)到飽和，或者是反應(yīng)體系中不斷增加的還原端基造成的產(chǎn)物抑制作用而導(dǎo)致了反應(yīng)速率的下降。

當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度高于0.20mg/mL及以上時(shí)，酶解反應(yīng)速率與酶解時(shí)間在整個(gè)酶解過程中始終保持線性增加關(guān)系。另外，在0.05mg/mL時(shí)，酶解反應(yīng)20min內(nèi)的產(chǎn)物生成量只有46μmol/mL，而動(dòng)力學(xué)參數(shù)如Km值的測(cè)定往往需要測(cè)定底物質(zhì)量濃度在Km值附近的酶解反應(yīng)速率。因此，MBTH法的高靈敏度足夠用來測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。然而，由于DNS法的靈敏度較低，其氨基葡萄糖的檢測(cè)限為320μmol/mL，很難檢測(cè)到產(chǎn)物還原端基濃度在200μmol/mL以下的酶解速率變化(圖2)，而增加酶濃度確實(shí)可以提高酶解速率從而增加產(chǎn)物濃度，但又會(huì)使酶解反應(yīng)背離零級(jí)反應(yīng)而很難測(cè)得酶解初速率，此外，在高底物濃度條件下，酶解速率變化不明顯(圖3)，會(huì)引入較大測(cè)量誤差，因此，用DNS法較難準(zhǔn)確測(cè)定Km值。在圖3的整個(gè)酶解過程中，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，酶解反應(yīng)速率逐漸遞增。在低底物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)速率與底物濃度呈線性增加關(guān)系。在底物質(zhì)量濃度增加到0.30mg/mL之后，反應(yīng)速率增加緩慢并最終趨于平緩。根據(jù)圖3雙倒數(shù)曲線公式為y=0.0303x+0.2494(R2=0.9957)計(jì)算可得Km為0.12mg/mL，遵循底物質(zhì)量濃度可盡量大，但又不影響測(cè)定的原則，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇2mg/mL(16.7倍的Km值)作為酶活力測(cè)定的底物終質(zhì)量濃度。

圖 3 底物質(zhì)量濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系和雙倒數(shù)曲線圖(MBTH法)Fig.3 Relationship between substrate concentration and reaction rate and Double reciprocal Lineweaver-Burk plots in MBTH method

2.3 MBTH法動(dòng)態(tài)測(cè)定殼聚糖酶活力及其比較

圖 4 不同酶質(zhì)量濃度條件下MBTH法動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Kinetic curves of various enzyme concentrations for MBTH method

由圖4可知，不同的酶質(zhì)量濃度條件下，酶解反應(yīng)速率(即單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量)隨時(shí)間呈線性增加關(guān)系。這一線性關(guān)系說明，在不同的酶質(zhì)量濃度條件下，酶解反應(yīng)均達(dá)到最大反應(yīng)速率，并且在60min內(nèi)保持恒定。另外，只有當(dāng)?shù)孜镉昧孔阋栽?0min內(nèi)使底物與酶的結(jié)合始終保持飽和狀態(tài)，才能保證酶解反應(yīng)速率恒定在最大值。因此，可以說明實(shí)驗(yàn)中所使用的底物質(zhì)量濃度要遠(yuǎn)大于酶對(duì)底物的Km值。在這樣的底物質(zhì)量濃度條件下，反應(yīng)速率會(huì)隨著酶質(zhì)量濃度增加成比例增加。在測(cè)定酶活力時(shí)，只有保證在測(cè)定過程中，酶解反應(yīng)速率始終保持在一個(gè)恒定的最大值，才能確保酶活力測(cè)定的準(zhǔn)確性。因此，在測(cè)定酶活力時(shí)，選擇在酶解反應(yīng)60min以內(nèi)測(cè)定酶活力是比較準(zhǔn)確的，因此，按照1.2.3節(jié)中的試管法即可以代替操作繁瑣的動(dòng)力學(xué)法用于常規(guī)酶活力測(cè)定。

圖 5 不同酶質(zhì)量濃度條件下鐵氰化鉀法動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 Kinetic curves of various enzyme concentrations for potassium ferricyanide method

圖 6 MBTH法、鐵氰化鉀法和DNS法測(cè)定酶質(zhì)量濃度曲線Fig.6 Enzyme concentration curves for MBTH, DNS and potassium ferricyanide method

鐵氰化鉀法測(cè)殼聚糖酶活力的動(dòng)力學(xué)曲線如圖5所示，其結(jié)果接近MBTH法，除在2.1節(jié)中所討論的由于該法屬減色法使檢測(cè)范圍較窄之外，較大的空白值也會(huì)使該酶活力的檢測(cè)限偏高，而且，由于該法取樣量較大，不利于在線監(jiān)測(cè)。另外，由于殼聚糖本身對(duì)鐵氰化鉀有一定吸附作用，因此，終止反應(yīng)后需馬上離心取上清液。盡管鐵氰化鉀法有諸多缺陷，但是，由圖6可知，其酶活力測(cè)定結(jié)果與MBTH法相近，以MBTH法的酶活力定義為基準(zhǔn)，其檢測(cè)限為20mU/mL，是MBTH法(13mU/mL)的1.6倍。

圖 7 不同酶質(zhì)量濃度條件下DNS法動(dòng)力學(xué)曲線Fig.7 Kinetic curves of various enzyme concentrations for DNS method

而對(duì)于DNS法而言，以MBTH法的酶活力定義為基準(zhǔn)，其檢測(cè)限為1.5U/mL，是MBTH法的116倍。如圖6和圖7所示，當(dāng)酶活力單位在1.5～21.6U/mL以內(nèi)時(shí)，酶解反應(yīng)速率與酶質(zhì)量濃度呈線性增加關(guān)系；當(dāng)酶解速率超過21.6U/mL時(shí)，盡管在不同酶質(zhì)量濃度條件下的酶動(dòng)力學(xué)曲線仍各呈線性遞增，但是，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，酶解反應(yīng)速率逐漸處于非線性遞增，最終曲線趨于平緩。這主要是因?yàn)槊笣舛冗^高，底物消耗過多，酶解產(chǎn)物導(dǎo)致產(chǎn)物抑制。另外，之所以動(dòng)力學(xué)曲線仍呈線性遞增，是由于DNS法所測(cè)還原端基的摩爾吸光系數(shù)與酶解產(chǎn)物的聚合度密切相關(guān)，而且，聚合度越低摩爾吸光系數(shù)越大[24-26]，從而造成線性動(dòng)力學(xué)曲線的假象，致使酶質(zhì)量濃度線性部分斜率(y=0.0641x－2.6419)超出鐵氰化鉀法法(y=0.0337x+0.0631)和MBTH法(y=0.0321x+0.0407)1倍之多，因此，DNS法測(cè)定殼聚糖酶活力是不準(zhǔn)確的，它不適于生產(chǎn)中的質(zhì)量控制、銷售等環(huán)節(jié)中的準(zhǔn)確定量。

3 結(jié) 論

建立了一種新的高靈敏度測(cè)定殼聚糖酶活力的方法——MBTH法，利用動(dòng)力學(xué)法研究了該活力測(cè)定方法的測(cè)定參數(shù)，在37℃、pH6.0反應(yīng)條件下殼聚糖底物溶液的終質(zhì)量濃度需在2mg/mL以上，酶解時(shí)間在60min以內(nèi)。MBTH法準(zhǔn)確、靈敏、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)便，可以用終點(diǎn)法定量測(cè)得殼聚糖酶活力，且可用于DNS法較難測(cè)得的較小Km值的測(cè)定。該法測(cè)定結(jié)果近似于鐵氰化鉀法，DNS法廣泛用于殼聚糖酶的篩選、分離純化、應(yīng)用中的工藝優(yōu)化，但不適于質(zhì)量控制、銷售等環(huán)節(jié)中的準(zhǔn)確定量。

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