鮑志寧，林偉鋒*，葉 君，熊 犍*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

目前，乳酸菌發(fā)酵乳制品種類繁多，在各國社會經濟和日常飲食中都起著重要作用[1-3]。高濃度發(fā)酵乳基料是一種新型的發(fā)酵乳制品，其蛋白質含量為6%～10%，而普通發(fā)酵乳中蛋白質含量為2.9%～3.5%[4]。高濃度發(fā)酵乳基料具有蛋白質含量高、氨基酸含量高和酸度高的特點，其作為一種創(chuàng)新型發(fā)酵乳基料將逐漸引起食品行業(yè)的關注。將發(fā)酵乳作為乳基料添加至其他食品中，如加至發(fā)酵乳飲料[5-6]和烘焙制品所用的香基[7-8]中也是發(fā)酵乳基的新型用途。

目前在奶味香基領域中，脂肪酶酶解乳脂制作香基已被廣泛應用[9]。但酶法所得香基香型單調，易呈酸敗味，因此將微生物發(fā)酵與酶法結合是制備高品質天然發(fā)酵乳香基料的重要途徑。現有研究中二者結合的研究主要為先發(fā)酵后酶解。于鐵妹等[10]將1.6%全脂乳經德氏乳桿菌發(fā)酵后再加入脂肪酶酶解獲得天然奶味香基料。Tsai等[11]在乳酸菌發(fā)酵5h后，結合蛋白酶酶解來去除蛋白質含量約為4%的發(fā)酵豆乳中的苦味并使其富含生物活性肽和γ-氨基丁酸(GABA)。而將乳酸菌發(fā)酵與酶解同步結合的研究很少，二者同步作用制備的高濃度發(fā)酵乳基料具有更為突出的發(fā)酵特征，將對發(fā)酵乳基料的研究和應用具有積極意義。

本實驗通過高濃度發(fā)酵乳基料及與復合酶制劑酶解同步結合，來改善和提高其酸度和氨基酸態(tài)氮含量等特征，以期為高濃度發(fā)酵乳基料的應用研究，提供新的實驗依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉(批號9121477) 雀巢公司；無水奶油(批號1233456) 新西蘭恒天然公司；干酪乳桿菌(Lactobacillus casei，LC-L134-1-P) 本實驗室保存；復合酶(脂肪酶與蛋白酶符合，脂肪酶活力15000U/L，蛋白酶酶活力1.4AU/L) 廣州華琪生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-25型pH計 上海精密科學儀器有限公司；SZX超凈工作臺 上海浦東躍新科學儀器廠；PYXDHS·400-BS恒溫培養(yǎng)箱 北京市醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 高濃度發(fā)酵乳基的制作

1.3.1.1 高濃度發(fā)酵乳基的配方

全脂奶粉30%(蛋白質含量7.8%)、無水奶油5%、水70%、菌種干酪乳桿菌0.4‰。

1.3.1.2 高濃度發(fā)酵乳基的工藝

1.3.2 復合酶對高濃度發(fā)酵乳基的影響

1.3.2.1 復合酶的添加對高濃度發(fā)酵乳基的影響

在接種/加酶時，1#樣僅接種干酪乳桿菌發(fā)酵；2#樣為僅添加復合酶酶解；3#樣為干酪乳桿菌發(fā)酵與復合酶酶解相結合。對比3種條件下高濃度發(fā)酵乳基發(fā)酵/酶解過程產物的變化。

1.3.2.2 不同的復合酶添加量對高濃度發(fā)酵乳基的影響

在接種/加酶時，分別添加0.1‰(4#樣)、0.2‰(5#樣)、0.3‰復合酶(6#樣)與乳酸菌發(fā)酵相結合，對比不同復合酶添加量對高濃度發(fā)酵乳基發(fā)酵過程的影響。

1.3.3 高濃度發(fā)酵乳基發(fā)酵過程中指標的測定

pH值的測定采用PHS-25型酸度計測定。酸度的測定采用°T表示發(fā)酵乳基的酸度[12]?；罹鷶档臏y定參見文獻[13]。氨基酸態(tài)氮含量的測定參見文獻[12]。

2 結果與分析

2.1 高濃度發(fā)酵乳基料發(fā)酵過程的發(fā)酵特性變化

圖 1 高濃度發(fā)酵乳基酸度隨發(fā)酵時間的變化Fig.1 Time course of pH and titratable acidity during fermentation

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，pH值下降，下降速率由低到高再降低，發(fā)酵72h時pH值降至3.93。而普通發(fā)酵乳(蛋白質含量3.0%，奶油含量0%)在發(fā)酵72h時pH值為3.6～3.7[14]。同時，隨著發(fā)酵時間的延長，高濃度發(fā)酵乳基料的滴定酸度上升，上升速率變化也與pH值下降速率變化相對應，發(fā)酵72h時滴定酸度為268.5°T。普通的發(fā)酵乳發(fā)酵72h時滴定酸度僅為125～135°T。由于高濃發(fā)酵乳基料具有較高的蛋白質含量和脂肪含量，對于干酪乳桿菌產生的乳酸有較強的緩沖作用，因此即使滴定酸度很高，pH值也僅為4.0左右。高濃發(fā)酵乳基料的滴定酸度是普通發(fā)酵乳的2倍，若應用于發(fā)酵乳飲料調配，添加量僅需20%～30%即可達到適宜的酸度。

圖 2 高濃度發(fā)酵乳基活菌數和氨基酸態(tài)氮隨發(fā)酵時間的變化Fig.2 Time course of the viable cell number of Lactobacillus casei and amino nitrogen content during fermentation

由圖2可知，干酪乳桿菌在發(fā)酵28h時由對數期進入穩(wěn)定期，與圖1中產酸速率變化拐點一致。同時，在發(fā)酵28～72h過程中，活菌數穩(wěn)定在1×109CFU/mL，這一方面是因為高濃度發(fā)酵乳基中含有大量的碳源和氮源，另一方面說明該干酪乳桿菌具有對較高酸度具有耐受性的特征[15]。圖2中氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵過程中的變化呈現緩慢波動上升的趨勢。乳酸菌在增殖過程中，不斷地分泌蛋白酶水解乳蛋白產生游離氨基酸，產生的游離氨基酸不僅用于滿足干酪乳桿菌對氮源的需要，而且可以作為發(fā)酵風味物質[16]。發(fā)酵72h后，高濃度發(fā)酵乳基中的氨基酸態(tài)氮含量由初始的0.097g/100g增加至0.117g/100g，提高了20.6%。而同樣菌株發(fā)酵72h，普通發(fā)酵酸奶的氨基酸態(tài)氮含量僅為0.061g/100g。

2.2 復合酶對高濃度發(fā)酵乳基料發(fā)酵的影響

圖 3 復合酶對高濃度發(fā)酵乳基酸度的影響Fig.3 Time course of pH and titratable acidity during simultaneous hydrilysis and fermentation

由圖3可知，僅添加復合酶的高濃度發(fā)酵乳基料(2#樣)pH值下降幅度比添加了干酪乳桿菌的高濃度發(fā)酵乳基料(1#樣和3#樣)小，發(fā)酵72 h時，2#樣pH值為5.21，而1#樣和3#樣pH值均為3.90，且二者在發(fā)酵過程中pH值變化趨勢基本一致。同時乳酸菌與復合酶相結合的高濃度發(fā)酵乳基料(3#樣)的滴定酸度遠高于1#樣和2#樣，近于2#樣滴定酸度的兩倍。發(fā)酵72 h時，3#樣滴定酸度為414.4°T， 2#樣僅為241.1°T。這是由于復合酶中的脂肪酶會將乳脂分解成脂肪酸，脂肪酸的羧基使乳基料具有較高的滴定酸度和pH值。3#樣中由于復合酶中的蛋白酶酶解乳蛋白，為乳酸菌提供了更多氨基酸作為速效氮源，促進了菌株的增殖和乳酸分泌，進而與脂肪酸協(xié)同獲得更高的滴定酸度。

圖 4 復合酶對高濃度發(fā)酵乳基活菌數和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Time course of the viable cell number of Lactobacillus casei and amino nitrogen content during simultaneous hydrilysis and fermentation

2#樣品在發(fā)酵過程中無菌落檢出。由圖4可知，3#樣中干酪乳桿菌于20h時從對數期進入穩(wěn)定期，1#樣則于28h轉折。同時在發(fā)酵50h之前，1#樣的活菌數均比3#樣高。這是因為乳酸菌內生性酶構成簡單，許多氨基酸不能由自身合成，因此乳酸菌培養(yǎng)時往往需要含有豐富氨基酸的物質來提供氮源[17-18]。蛋白酶分解的氨基酸作為速效氮源促進菌株生長繁殖，但氮源過多則會使菌體生長過于旺盛，反而加速菌體的衰老和自溶[19-20]，菌株分裂與衰退均加速，因此活菌數沒有明顯增加。隨著酶解脂肪酸的積累使滴定酸度大幅升高，也在一定程度上抑制了干酪乳桿菌的生長。因此3#樣在發(fā)酵20～72h活菌數保持平穩(wěn)。2#樣和3#樣的氨基酸態(tài)氮含量隨著酶解和發(fā)酵時間的延長不斷增加，并且比1#樣有大幅提高。在72h處，氨基酸態(tài)氮含量1#樣為0.117g/100g，2#樣為0.131g/100g，3#樣為0.132g/100g，3#樣比1#樣提高12.8%。

因此，乳酸菌發(fā)酵劑與酶制劑復配將發(fā)酵和酶解同步進行獲得的高濃度發(fā)酵乳基料具有更高的酸度和氨基酸態(tài)氮含量，使其作為一種發(fā)酵乳基料的特征更為突出，更有利于其在各類食品中的應用。

2.3 不同復合酶添加量對高濃度發(fā)酵乳基料發(fā)酵的影響

圖 5 不同復合酶添加量對高濃度發(fā)酵乳基酸度的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on pH and titratable acidity

由圖5可知，3種不同濃度的復合酶添加量(4#樣0.1‰，5#樣0.2‰，6#樣0.3‰)的高濃度發(fā)酵乳基料pH值變化趨勢和數值是完全一致的，最終pH值在3.92～3.98之間。而滴定酸度則受復合酶添加量的影響明顯，復合酶添加量高的高濃度發(fā)酵乳基料滴定酸度也相應較高，由高到低依次為409.2、361.2、350.1°T，同時3個樣品的滴定酸度變化趨勢是基本一致。因此可以選擇不同的復合酶添加量和發(fā)酵時間來滿足不同的產品需求。

由圖6可知，3個樣品在活菌數變化趨勢和數值上是完全一致的，這可能是因為復合酶中蛋白酶酶解乳蛋白產生氨基酸的量遠遠超過干酪乳桿菌增殖需要，以及當酸度超過某個值其對干酪乳桿菌的抑制程度也趨向一致。高濃度發(fā)酵乳基料的氨基酸態(tài)氮含量隨著復合酶添加量的增加在發(fā)酵后期(46h之后)有不同程度的提高，4#樣為0.125g/100g，6#樣為0.134g/100g。3個樣品氨基酸態(tài)氮含量的變化趨勢也與滴定酸度保持一致。

3 結 論

本實驗研究了蛋白質含量為7.8%的高濃度發(fā)酵乳基料在發(fā)酵過程中的動力學參數變化情況，獲得的高濃度發(fā)酵乳基料的滴定酸度和氨基酸態(tài)氮含量均較高，同時高濃度緩沖體系使pH值也較高，干酪乳桿菌LC-L134-1-P對酸的良好耐受性使其活菌數穩(wěn)定在1×109CFU/mL左右。本實驗進一步將復合酶制劑與乳酸菌發(fā)酵劑復配獲得的高濃度發(fā)酵乳基料具有更高的酸度和氨基酸態(tài)氮含量。同時復合酶含量越高，高濃度發(fā)酵乳基料的酸度和氨基酸態(tài)氮含量越高。綜合看來，經過發(fā)酵和酶解的高濃度發(fā)酵乳基料具有更高的酸度和氨基酸態(tài)氮含量的特征，接下來將對其在發(fā)酵過程中酶與發(fā)酵劑同步作用機理，以及高濃度發(fā)酵乳基料在風味、在焙烤等食品中的增香應用和功能性做更深入研究。

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