杜 坤，周 麗，堵國(guó)成，陳 堅(jiān),2，周哲敏,*

(1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13)是一種能夠催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶。它可以催化谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與各種?；荏w發(fā)生反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間發(fā)生交聯(lián)，從而極大地改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)[1]。因此谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在食品工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[1]，例如重組肉塊，增強(qiáng)和改善食品的風(fēng)味，延長(zhǎng)某些食品的保質(zhì)期等。另外谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在生物醫(yī)藥、組織工程、紡織和皮革工業(yè)中也有著廣泛的應(yīng)用前景[2]，例如修飾蛋白類(lèi)藥物以延長(zhǎng)其半衰期，用于器官再造技術(shù)，增強(qiáng)羊毛類(lèi)和蠶絲類(lèi)紡織原料的韌性等。

目前，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的生產(chǎn)方法主要有2種：從動(dòng)物組織中提取和利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)[3]。由于從動(dòng)物組織中提取的TGase價(jià)格昂貴，限制了其應(yīng)用，因而開(kāi)發(fā)微生物發(fā)酵生產(chǎn)TGase(microbial tranglutaminase，MTG)的方法成為了研究熱點(diǎn)。1989年，日本味之素公司首次在土壤中分離到MTG生產(chǎn)菌株茂原鏈輪絲菌Streptoverticillium mobaraense S-8112[4]。此后，新的TGase生產(chǎn)菌株不斷被發(fā)現(xiàn)，包括鏈霉菌屬的 Streptomyces netropsis[5]、Streptomyces hygroscopicus[6]，芽孢桿菌屬的Bacillus subtilis[7]、Bacillus circulans[8]等。至今，多個(gè)來(lái)源于鏈霉菌屬(Streptomyces)的MTG已經(jīng)在大腸桿菌、酵母、鏈霉菌及谷氨酸棒桿菌等宿主中成功表達(dá)[9]，且大部分以酶原的形式(pro-MTG)。鏈霉菌來(lái)源的MTG在異源表達(dá)過(guò)程中存在兩個(gè)問(wèn)題：直接表達(dá)成熟酶基因，基本以包涵體的形式存在[10]，且包涵體復(fù)性成本高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；pro-MTG需要蛋白酶活化，外加蛋白酶會(huì)增加MTG的分離純化成本，同時(shí)外加蛋白酶可能會(huì)降解MTG以及其作用的底物[11]。因此需要探索簡(jiǎn)易、高效、廉價(jià)的MTG制備方法[12]。

蛋白質(zhì)剪接是一個(gè)翻譯后自催化加工過(guò)程，它不需要酶或其他輔因子的參與。在這個(gè)過(guò)程中，前體蛋白的內(nèi)含肽(intein)被切離，其兩側(cè)的外顯肽(extein)被連接在一起[13]。對(duì)Intein進(jìn)行改造，可以阻斷兩端外顯肽的連接過(guò)程，但不影響Intein的N端肽鍵或C端肽鍵的斷裂。Ssp Dna B mini intein(SMI)是經(jīng)過(guò)改造的微型內(nèi)含肽，它在pH 6.0～7.5范圍內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)C端肽鍵的高效斷裂(N端斷裂被阻斷)[14]。該內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接技術(shù)已在蛋白質(zhì)合成、分離純化等領(lǐng)域被成功應(yīng)用，尚未見(jiàn)其應(yīng)用于酶原蛋白質(zhì)的成熟過(guò)程。

本研究在pro區(qū)和MTG之間插入SMI，通過(guò)環(huán)境pH值的變化來(lái)控制MTG的成熟過(guò)程，并考察了內(nèi)含肽的插入對(duì)于重組MTG結(jié)構(gòu)和功能的作用。該酶原活化方法避免了添加外源蛋白酶所產(chǎn)生的副作用，具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus) WSH03-13、大腸桿菌(Escherichia coli) BL21(DE3)、JM109、質(zhì)粒pET22b(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pTWIN1 美國(guó)NEB公司。

限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ、XhoⅠ、DpnⅠ、Primer STARTMHS DNA Polymerase 日本TaKaRa公司；金屬鎳親和層析柱(HisTrap HP(1mL))、陽(yáng)離子交換層析柱(HiTrap SP HP (1mL)) 美國(guó)GE公司；N-CBZ-Gln-Gly 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的S.hygroscopicus WSH03-13的pro-MTG基因序列(GenBank登錄號(hào)：HM231108)設(shè)計(jì)引物，以S. hygroscopicus WSH03-13總DNA為模版，PTG-up和PTG-down為引物(表1)，擴(kuò)增pro-MTG基因。將PCR產(chǎn)物用NcoⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，然后連接pET22b(+)，構(gòu)建載體pET-pro-MTG。以pTWIN1為模版，SMI-up和SMI-down為引物(表1)，擴(kuò)增SMI基因。SMI-up和SMI-down的5’端分別與pro區(qū)的3’端和MTG的5’端互補(bǔ)配對(duì)。以SMI的PCR產(chǎn)物作為引物，pET-pro-MTG為模板，進(jìn)行全質(zhì)粒擴(kuò)增，將所獲得PCR產(chǎn)物用DpnⅠ消化甲基化模版pET-pro-MTG后，轉(zhuǎn)化入E. coli JM109中，得到重組質(zhì)粒pET-proSMIMTG，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)表達(dá)重組酶。以上所有質(zhì)粒均經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。

表 1 所涉及的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 培養(yǎng)條件

TB培養(yǎng)基(蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油4mL/L、KH2PO42.3g/L、K2HPO4·3H2O 16.4g/L)加入終質(zhì)量濃度為葡萄糖4g/L、乙醇1%、氨芐青霉素50mg/L，將菌株E.coli BL21(DE3)/pET-proSMIMTG在該培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)至OD600nm達(dá)0.6，加入終濃度為0.8mmol/L IPTG，18℃條件下誘導(dǎo)24h。

1.2.3 SMI斷裂時(shí)間的確定、蛋白純化及周質(zhì)空間蛋白的提取

收集E. coli BL21(DE3)/pET-proSMIMTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，在冰浴條件下超聲破碎，1200×g離心10min，收集上清并將其pH值調(diào)至7.0，25℃條件下放置一定時(shí)間，使內(nèi)含肽C端斷裂，轉(zhuǎn)化proSMIMTG為MTG。接著利用金屬鎳親和層析柱HisTrap HP (1mL)和陽(yáng)離子交換層析柱HiTrap SP HP(1mL)純化目標(biāo)蛋白，利用SDS-PAGE凝膠電泳來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白純度。野生型MTG的純化方法參照文獻(xiàn)[6]。利用滲透壓沖擊法提取周質(zhì)空間蛋白，方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.2.4 圓二色譜

將野生型和重組型的MTG用10mmol/L磷酸鉀緩沖液(KPB)稀釋至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.2mg/mL。目標(biāo)蛋白的圓二色譜通過(guò)MOS-450/AF-CD分光偏振計(jì)在25℃條件下測(cè)得，吸收池寬0.1cm，掃描波長(zhǎng)為190～250nm。平均殘基橢圓率[θ]=569.3×θ，θ為測(cè)得值，[θ]的單位為(deg·cm2)/dmol。

1.2.5 N末端氨基酸序列測(cè)定

采用SDS-PAGE垂直電泳，12%分離膠、5%濃縮膠；電泳緩沖液為T(mén)ris-甘氨酸緩沖液(pH8.3，含0.1% SDS)；樣品緩沖液為0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液(含2% SDS、5% β-ME、10%甘油和0.02%溴酚藍(lán))；將經(jīng)過(guò)金屬鎳親和層析柱HisTrap HP (1mL)和陽(yáng)離子交換層析柱HiTrap SP HP (1mL)純化后的MTG樣品溶于樣品緩沖液中(終質(zhì)量濃度為0.2mg/mL)，于100℃中加熱5min， 10000×g離心10min后上樣。采用直流恒壓電源；濃縮膠電壓為60V，分離膠電壓為140V，電泳時(shí)間為2～3h。電泳結(jié)束后，將蛋白膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、染色、干燥后，由上?；瞪锛夹g(shù)公司進(jìn)行N末端氨基酸序列的測(cè)定。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

以N-CBZ-Gln-Gly (0～30mmol/L)為底物，用比色法測(cè)定重組MTG酶活力。取40μL酶液，37℃預(yù)熱1min，加入預(yù)熱的底物(30mmol/L CBZ-Gln-Gly、100mmol/L NH2OH、10mmol/L還原型谷胱甘肽、50mmol/L Tris-HCl (pH 6.0)，反應(yīng)10min后加入40μL終止劑(1mol/L HCl、4%三氯乙酸、5% FeCl3·6H2O)，10000×g離心10min，525nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸光度[6]。一個(gè)單位MTG酶活力的定義為：37℃時(shí)每分鐘催化形成1μmol L-谷氨酸-γ-單羥基肟酸的酶量。測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)，通過(guò)Lineweaver-Burk曲線獲得Km和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)蛋白的表達(dá)

圖 1 proSMIMTG的結(jié)果表達(dá)Fig.1 Expression of proSMIMTG

對(duì)E. coli BL21(DE3)/pET-proSMIMTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將乙醇和葡萄糖加入培養(yǎng)基中，以此減少包涵體的形成[16]。由圖1可知，重組蛋白proSMIMTG(pro-Intein-MTG)成功實(shí)現(xiàn)了可溶表達(dá)。大腸桿菌中，pelB信號(hào)肽可引導(dǎo)目標(biāo)蛋白穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜，分泌到周質(zhì)空間中，進(jìn)而蛋白質(zhì)可非特異性地滲漏到細(xì)胞外，實(shí)現(xiàn)胞外分泌表達(dá)。Liu Song等[17]報(bào)道，S. hygroscopicus WSH03-13來(lái)源的pro-MTG在pelB信號(hào)肽的引導(dǎo)下，可以實(shí)現(xiàn)胞外分泌表達(dá)。在本研究中，借助相同的信號(hào)肽，proSMIMTG或重組MTG未分泌到細(xì)胞外，而是在周質(zhì)空間中積累(圖2)。此外，在發(fā)酵的過(guò)程中可檢測(cè)到MTG的活性，表明周質(zhì)空間的pH環(huán)境可引起SMI發(fā)生C端斷裂，導(dǎo)致MTG的產(chǎn)生，發(fā)酵結(jié)束時(shí)MTG酶活力為0.09U/mL(菌體濃度稀釋至OD600nm為1.0時(shí)測(cè)得)。據(jù)報(bào)道，成熟的MTG在Lactococcus lactis體內(nèi)能夠使該菌的細(xì)胞壁變厚，使得即使是小分子的肽也不能進(jìn)入該菌體內(nèi)[18]。因此推測(cè)，發(fā)酵過(guò)程中非特異性激活的MTG因其交聯(lián)蛋白的能力，導(dǎo)致大腸桿菌的外膜變厚，從而影響了proSMIMTG從周質(zhì)空間滲漏到細(xì)胞外。

圖 2 SDS-PAGE檢測(cè)周質(zhì)空間蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis of periplasmic proteins

2.2 SMI斷裂時(shí)間的確定及目標(biāo)蛋白的純化

圖 3 proSMIMTG斷裂時(shí)間的確定及重組MTG的純化Fig.3 Cleavage time of proSMIMTG and the purifi cation of recombinant MTG

SMI的C端外顯肽的第1個(gè)氨基酸對(duì)于其C端斷裂過(guò)程起著重要的作用。當(dāng)?shù)?個(gè)氨基酸為谷氨酰胺、天冬酰胺、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸或者脯氨酸時(shí)，斷裂過(guò)程被阻斷。為其他氨基酸時(shí)則可以發(fā)生C端斷裂[14]。MTG作為SMI的C端外顯肽，且第1個(gè)氨基酸為天冬氨酸，因而可以實(shí)現(xiàn)SMI的C端斷裂。調(diào)節(jié)細(xì)胞破碎上清液pH值至7.0并放置于25℃環(huán)境中，SDS-PAGE和酶活力測(cè)定顯示，proSMIMTG可以在24h內(nèi)通過(guò)SMI的C端斷裂完全轉(zhuǎn)化為MTG(圖3)，且最高酶活力可達(dá)0.23U/mL(菌體濃度稀釋至OD600nm為1.0時(shí)測(cè)得)。該結(jié)果是在大腸桿菌內(nèi)將pro區(qū)和MTG共表達(dá)所得酶活力的1.7倍[19]。

重組MTG經(jīng)過(guò)親和層析柱Histrap HP (1mL)(重組MTG的C端融合HisTag)和離子交換層析柱HiTrap SP HP (1mL)從放置24h的細(xì)胞破碎上清液中純化獲得。

2.3 重組型和野生型MTG的酶學(xué)性質(zhì)

表 2 重組型和野生型MTG的酶學(xué)性質(zhì)比較Table 2 Characterization of wild-type and recombinant MTG

通過(guò)比色法測(cè)定MTG的活性，研究?jī)?nèi)涵肽的插入是否影響重組MTG的酶活。由表2可知，重組型MTG的酶比活力為14.3U/mg，Km為69.4mmol/L。該結(jié)果和野生型相同。因而內(nèi)含肽的插入對(duì)于MTG的活性沒(méi)有影響。重組MTG的N末端氨基酸序列測(cè)定結(jié)果表明，proSMIMTG中SMI的斷裂位點(diǎn)與理論斷裂位點(diǎn)相同。

2.4 重組型和野生型MTG的二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

圖 4 重組型和野生型MTG的圓二色譜Fig.4 Circular dichroism spectra of recombinant and wild type MTG

為了探究?jī)?nèi)含肽的插入對(duì)于MTG結(jié)構(gòu)的影響，通過(guò)圓二色譜對(duì)重組型和野生型MTG的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(表3)顯示兩者在二級(jí)結(jié)構(gòu)上相近，因而可以推測(cè)重組型和野生型MTG的空間結(jié)構(gòu)上相似。這表明內(nèi)含肽的插入對(duì)于MTG的結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有影響。

表 3 重組型和野生型MTG的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of the secondary structure compositions of wildtype and recombinant MTG

3 討 論

TGase廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，在生命體中發(fā)揮著重要的作用。動(dòng)物中的TGase與血液凝固、傷口愈合、表皮角質(zhì)化等生物現(xiàn)象有關(guān)，且參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增值等多種功能[20]。植物中的TGase的具體功能還有待探究。微生物中的TGase則主要參與細(xì)胞壁的形成、菌絲體的分化等方面[21]。與其他來(lái)源的TGase相比，MTG具有不依賴(lài)于Ca2+，分子質(zhì)量適中(23～45kD之間)，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，pH值穩(wěn)定范圍寬，底物譜廣，反應(yīng)速度快等優(yōu)勢(shì)[1]。MTG的生產(chǎn)現(xiàn)狀是菌體先分泌出酶原，再利用蛋白酶活化獲得MTG。無(wú)論是外源添加蛋白酶，還是將pro-MTG和蛋白酶共表達(dá)，都不可避免的需要將蛋白酶與MTG進(jìn)行分離純化，該過(guò)程會(huì)增加MTG的生產(chǎn)成本。另外，商品化的MTG在分離純化過(guò)程中很難將蛋白酶完全去除[22]，而蛋白酶存在降解MTG以及其作用的底物的可能，這也會(huì)限制MTG的應(yīng)用。本研究通過(guò)在pro-MTG的pro區(qū)和MTG之間插入內(nèi)含肽，使得MTG的活化過(guò)程變的簡(jiǎn)便、可控，酶活和圓二色譜結(jié)果進(jìn)一步顯示內(nèi)含肽對(duì)于MTG的結(jié)構(gòu)和性能幾乎沒(méi)有影響，更加顯示了該方法的優(yōu)越性。

將pro和MTG進(jìn)行共表達(dá)，同樣不需蛋白酶的活化，直接獲得有活性的MTG[19,23]。而本研究中表達(dá)pro-Intein-MTG，降低了MTG的活性對(duì)宿主細(xì)胞的傷害，進(jìn)而MTG的最終酶活力提高為pro和MTG共表達(dá)的1.7倍，達(dá)到0.23U/mL(菌體濃度稀釋至OD600nm為1.0時(shí)測(cè)得)。同時(shí)，在發(fā)酵過(guò)程中已能檢測(cè)到MTG的活性，因而MTG很可能因其交聯(lián)蛋白質(zhì)的特性對(duì)周質(zhì)空間蛋白的功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響宿主的生長(zhǎng)、目標(biāo)蛋白的表達(dá)及目標(biāo)蛋白的滲漏分泌，因此在發(fā)酵過(guò)程中抑制SMI的C端斷裂活性或選用其他裂解調(diào)控更加嚴(yán)密的內(nèi)含肽可能會(huì)進(jìn)一步提高重組蛋白(pro-Intein-MTG)的表達(dá)量或?qū)崿F(xiàn)其胞外分泌。

本方法對(duì)于其他酶原類(lèi)蛋白酶的表達(dá)也有一定的借鑒意義。一般蛋白酶以酶原的形式(pro-enzyme)表達(dá)，并可以自發(fā)水解pro區(qū)實(shí)現(xiàn)自身的活化[24]。但是當(dāng)?shù)鞍酌覆荒軌蚣皶r(shí)分泌到胞外，則有可能因?yàn)槠渌獾鞍踪|(zhì)的能力對(duì)宿主的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白表達(dá)量過(guò)低。應(yīng)用本研究方法，則可以控制酶原的成熟過(guò)程，避免上述問(wèn)題，為目標(biāo)蛋白的高水平表達(dá)提供可能。

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