魯 倩，林親錄，吳 偉，高 宇，方婧杰，梁 盈，2，*

(1.中南林業(yè)科技大學，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南長沙410004;2.華南理工大學，淀粉與植物蛋白深加工教育部工程研究中心，廣東廣州510630)

隨著蛋白質(zhì)組學［1］的深入研究，急迫需要具有優(yōu)良功能的蛋白質(zhì)作為食品原料，而蛋白質(zhì)通過改性可以使其功能性質(zhì)得到更好的發(fā)揮。蛋白質(zhì)的糖基化［2］是重要的翻譯后修飾，它調(diào)控著生物體的生命活動，超過50%的細胞會被修飾成具有獨特生物活性的糖蛋白。這些糖蛋白［3］在各自的體系中發(fā)揮著與生物免疫、抗病毒、抗氧化等密切聯(lián)系的功能。鑒于糖基化作用與人類的一些疾病(糖尿病、心血管病、白內(nèi)障等)及衰老的關(guān)系［4］，擴大了蛋白質(zhì)在醫(yī)學及營養(yǎng)學領(lǐng)域的用途。蛋白質(zhì)的糖基化修飾，實質(zhì)就是美拉德反應(yīng)，整個過程都是自發(fā)的，這給天然抗氧化劑的尋找和應(yīng)用開辟了新道路［5］。自由基［6］是人體的中間代謝產(chǎn)物，通常在體內(nèi)處于動態(tài)平衡，不表現(xiàn)出對組織、細胞功能的損傷。然而，隨著年齡增長、環(huán)境污染、輻射等各種因素將導致體內(nèi)自由基過剩，進而破壞正常細胞，引起癌癥、動脈硬化、高血壓等各種疾病。抗氧化劑(如BHA、BHT［7］)能有效清除自由基，抑制或減緩氧化反應(yīng)，但有研究表明這些物質(zhì)可能對人體健康有一定的不良影響，因此尋找一種新型抗氧化劑對食品工業(yè)是至關(guān)重要的。目前，已有不少學者主張通過美拉德反應(yīng)［8］制備產(chǎn)物(MRPs)加入食品體系，從而提高產(chǎn)品抗氧化穩(wěn)定性［9］，并且它作為一種“綠色”食品添加劑，符合現(xiàn)代社會對食品的要求。

1 糖基化修飾

蛋白質(zhì)糖基化是指在肽鏈生物合成的同時或合成后，在酶的催化作用下，將糖鏈連接到肽鏈上特定糖基化［10］位點的過程。糖基化修飾按糖肽鏈的不同進行分類。

1.1 N-糖基化

通常指糖鏈共價連接在蛋白質(zhì)的天冬酰胺(Asn)的氨基酸側(cè)鏈處，糖鏈與Asn 殘基的連接發(fā)生在三個殘基的特殊識別序列(Asn-X-Ser/Thr，其中X 為除Pro 和Asp 以外的任何氨基酸)處。N-糖鏈［11］分為三種:高甘露糖型、復雜型和混合型。所有的N-糖鏈都有一個相同的五糖核心結(jié)構(gòu)，由2 個N-乙酰葡萄糖胺連接3 個甘露糖組成。這類糖基化修飾有N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶參與完成。在該酶作用下，將供體UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的GlcNAc 轉(zhuǎn)移到甘露糖。

1.2 O-糖基化

一般指多糖與絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、羥賴氨酸、羥脯氨酸殘基上的羥基氧連接形成的，其糖鏈多數(shù)為N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、巖藻糖。O-糖基化［12］沒有一種確定的核心結(jié)構(gòu)，最常見的是由N-乙酰半乳糖胺與絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基氧連接，再加上不同數(shù)量的單糖分子延伸而成。

1.3 C-糖基化

C-糖基化是由甘露吡喃糖基與色氨酸吲哚環(huán)的C2通過C-C 鍵連接而成。這種修飾需要特定的氨基酸模序Trp-X-X-Trp、Trp-X-X-Cys、Trp-X-XPhe，X 為任意氨基酸，修飾位置都是第一位的色氨基酸殘基，這種糖基化修飾比較少見。

由此可見，國內(nèi)外對糖基化的研究主要集中在N-糖基化和O-糖基化，主要利用不同的糖基供體來使反應(yīng)進行的更順利。因此，通過研究具體的修飾過程進而選擇合理的糖基供體是實驗的關(guān)鍵。

2 糖基化反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化機理

糖基化反應(yīng)產(chǎn)物主要有類黑精、還原酮及一系列含N、S 雜環(huán)化合物。研究表明，這類物質(zhì)有一定的抗氧化性，其中某些物質(zhì)的抗氧化強度可以與食品中常用抗氧化劑相媲美［13］。

2.1 類黑精

由于美拉德中間產(chǎn)物的高反應(yīng)活性和復雜的聚合作用和脫水作用的發(fā)生，就形成了褐色的類黑精［14］。主要有三種結(jié)構(gòu)的類黑精［15］:蛋白質(zhì)與低分子量著色化合物交聯(lián)產(chǎn)生的以蛋白質(zhì)為基本成分的類黑精;由呋喃或吡咯重復單元組成的類黑精聚合物;醇醛縮合形成糖降解產(chǎn)物中的以碳水化合物為基礎(chǔ)的類黑精。

最近，國內(nèi)外對類黑精物質(zhì)的抗菌和抗氧化作用進行了大量研究。據(jù)日本媒體報道，類黑精作為非消化性高分子化合物存在于消化器官中，發(fā)揮著類似食物纖維素的生理機能，不但促進血清膽固醇降低，還可以使腸道內(nèi)乳酸菌素增值。師成斌、張曉云［16］等從黑麥芽中提取出類黑精(MBM)，并測定其還原力和對DPPH·的清除率。結(jié)果表明:MBM 的還原力和對DPPH·的清除能力都達到了較高水平，證明黑麥芽類黑精具有較強的抗氧化性，具有開發(fā)保健型啤酒和天然抗氧化劑的潛力。王亞君［17］等發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺與類黑精生成量相關(guān)，在食品的熱加工過程中，天門冬酰胺和還原糖會發(fā)生反應(yīng)生成具有神經(jīng)和遺傳毒性及致癌性的丙烯酰胺，同時還會生成具有顯著抗氧化活性功能的類黑精類物質(zhì)。加入外源性抗氧化劑(如維生素C、大蒜素等)可有效抑制丙烯酰胺的環(huán)氧化過程。類黑精類物質(zhì)具有相同顯著的抗氧化、抗誘變和消除活性氧等性能，其抗氧化強度可與食品中常用的抗氧化劑(如:BHA、BHT、維生素C 等)相媲美。

2.2 還原酮

美拉德反應(yīng)的初始階段，還原糖和氨基酸反應(yīng)即可生成不穩(wěn)定的氨基還原酮，參與系列反應(yīng)，形成褐色物質(zhì)，導致食品褐變。MRPs 中的還原酮具有還原和螯合作用，這能起到抗氧化的作用。

Gu［18］等研究了酪蛋白和葡萄糖反應(yīng)得到的美拉德產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果表明反應(yīng)所得的MRPs 分子質(zhì)量越高，其表現(xiàn)出的還原能力和金屬螯合活性越好。MRPs 中的還原酮提供氫原子進而打破自由基鏈式反應(yīng)，還原酮可以與一些過氧化物的前體物反應(yīng)阻止過氧化物的生成，從而達到抗氧化目的。

2.3 含N、S 雜環(huán)化合物

揮發(fā)性雜環(huán)化合物具有抗氧化性能，這類化合物主要是噻吩、噻唑、唑、呋喃和吡嗪等含S、N 的雜環(huán)化合物。

Osada［19］等從不同氨基酸和葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生物中提取揮發(fā)性化合物，并測定不同濃度的揮發(fā)性化合物對己醛氧化的抑制率。結(jié)果表明濃度高于20μg·mL-1的揮發(fā)性化合物表現(xiàn)出對己醛氧化的抑制作用。這類物質(zhì)具有的抗氧化性是由于具有芳香特性的五元和六元雜環(huán)化合物中6 個π 電子非定域分布于環(huán)上，使碳原子上電子過剩，由于碳原子上π電子云密度提高而有助于自由基親電加成，起到抗氧化的效果。

在圖1 五元和六元雜環(huán)化合物中，6 個π 電子非定域分布于環(huán)上，由于雜原子的存在，使π 電子密度分配不均。吡嗪中兩個N 原子從四個C 原子上拉π電子以補充其不足，而呋喃、唑、噻吩的電子都分布在五個原子上，使C 原子上電子過剩。五元雜環(huán)化合物碳原子上π 電子密度有助于自由基的親電加成，即表現(xiàn)出較強的抗氧化性能;而缺少π 電子的吡嗪不能進行親電加成進而無抗氧化能力。

圖1 五元和六元雜環(huán)化合物上π 電子密度Fig.1 The electron density of five and six-membered heterocyclic compounds

3 糖基化反應(yīng)對產(chǎn)物抗氧化性能的影響

產(chǎn)物糖基化后其抗氧化活性會有所增加，一般是測定產(chǎn)物的體內(nèi)和體外抗氧化活性。體內(nèi)活性通常采用小鼠實驗，而其體外活性一般是通過測定產(chǎn)物總還原能力，測定H2O2的清除效果，脂質(zhì)體過氧化抑制能力，O2-、·OH、DPPH·及ABTS+自由基清除能力等來實現(xiàn)。魯偉等人［20］將抗氧化性能用測定MRPs 清除DPPH·能力大小表示;馬志玲等人［21］通過β-胡蘿卜素-亞油酸模式體系以及亞油酸過氧化方法評價了MRPs 的抗氧化能力;王惠英等人［22］用流動注射化學發(fā)光法考察了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除活性。

表1 不同糖基化反應(yīng)因素對產(chǎn)物抗氧化性能的影響Table 1 The impact of different factors on the product of oxidation resistance

糖基化反應(yīng)，其實質(zhì)是氨基酸與還原糖的反應(yīng)，過程中需要考慮不同因素［23］對其反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性能的影響，包括合適的pH，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間，反應(yīng)物濃度，以及不同種類的還原糖和氨基酸等，表1總結(jié)了近幾年研究者們獲得較強抗氧化能力產(chǎn)物時的不同影響因素。

4 糖基化反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性研究

4.1 產(chǎn)物體外抗氧化活性研究

早在1953 年，Hodge 和Rist［30］就首先報道了有關(guān)MRPs 具有防止植物油氧化的效果。Frnazke 和Ivainsky［31］在1954 年也注意到MRPs 具有抗氧化性，初步研究了向人造奶油中添加甘氨酸-葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)物可提高人造奶油的氧化穩(wěn)定性。萬素英等［32］報道在弱酸性(pH=5～7)條件下，木糖-賴氨酸MRPs 的抗氧化活性較木糖-甘氨酸MRPs 的抗氧化活性高。有報道顯示，木糖與甘氨酸、木糖與賴氨酸、木糖與色氨酸、二羥基丙酮與組氨酸、二羥基丙酮與色氨酸、殼聚糖和葡萄糖的氧化產(chǎn)物有很好的抗氧化作用。

4.2 產(chǎn)物體內(nèi)抗氧化活性研究

為了將糖基化產(chǎn)物的抗氧化應(yīng)用到人體中，必須通過小鼠進行一系列研究。田甜等人［33］選取健康小鼠隨機分組，分組每日定時灌胃覆盆子糖蛋白粗提物并飼喂，在末次灌胃后禁食12h，摘除眼球進行眼眶采血，迅速解剖取出肝、腦、腎、胸腺、脾、心臟等臟器，冷凍備用，并制備血清和組織勻漿將上清液傾入潔凈試管低溫保存?zhèn)溆?，通過測定小鼠血清、肝臟、腦組織中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的變化，研究覆盆子糖蛋白粗提物對小鼠體內(nèi)抗氧化性的影響。結(jié)果表明:覆盆子糖蛋白粗提物可顯著增強小鼠血清、肝臟、腦組織中CAT、SOD、GSH-Px活性。

4.3 生物學水平抗氧化活性的研究

從生物學水平研究糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性擴大了其在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用。張瑛等人［34］通過動物細胞研究AGE(晚期糖基化終產(chǎn)物)證實AGE 修飾的血清白蛋白顯著促進動脈粥樣斑塊的形成，斑塊部位血管內(nèi)膜下的炎癥細胞浸潤顯著增強。這些結(jié)果提示AGE 修飾蛋白可能參與了動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的急性炎癥階段，促進白細胞通過血管內(nèi)皮屏障遷移至內(nèi)膜下。廖劍等人［35］應(yīng)用基于小扁豆凝集素親和的糖蛋白質(zhì)組學技術(shù)，分析和鑒定肝癌血清中巖藻糖基化異常的糖蛋白質(zhì)組，并驗證其診斷肝癌的潛能。

4.4 抗氧化產(chǎn)物在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

通過美拉德反應(yīng)制得的產(chǎn)物已大量應(yīng)用到食品工業(yè)的實際生產(chǎn)中。于汐洋等人［36］利用膜分離手段考察咸味香精中的肉味香基以及不同分子量的MRPs 對卵磷脂脂質(zhì)體的抗氧化效果。結(jié)果表明，肉味香基對脂質(zhì)體過氧化有抑制能力，其抗氧化能力隨反應(yīng)物濃度的增加而增強。陳黎洪等人［37］分析金華火腿副產(chǎn)品酶解物的組成，通過與葡萄糖、木糖進行反應(yīng)制MRPs，經(jīng)體外實驗評定MRPs 的抗氧化活性，隨反應(yīng)時間延長，金華火腿副產(chǎn)品酶解物的MRPs 顏色不斷加深，DPPH·清除率與還原力均呈上升趨勢。張陸霞等人［38］用復合蛋白酶水解鱈魚排來抽提魚肉骨蛋白，利用獲得的可溶性蛋白與木糖、葡萄糖、混合糖制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，測定其還原能力和清除DPPH·能力。實驗證明:鱈魚排水解蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是一種具有較強抗氧化性的營養(yǎng)風味型食品添加劑。

5 展望

近年來，糖基化反應(yīng)被廣泛應(yīng)用到食品加工中，尤其是對大豆蛋白，大米蛋白，乳清蛋白的修飾。我們課題組［39］已經(jīng)對糖基化修飾大米蛋白對其功能性質(zhì)的影響做了大量研究，實驗證明通過一系列改性條件的優(yōu)化，新合成的糖蛋白的溶解性、乳化性、熱穩(wěn)定性、抗菌性和抗氧化性等功能性質(zhì)得到了極大改善，尤其是限制大米蛋白進一步加工利用的溶解性得到了顯著的提高。而糖基化修飾對產(chǎn)物抗氧化性能的提升，不僅能有效清除人體中過剩的自由基達到抗衰老作用，也能進一步延緩血管和組織的老化，對心腦血管疾病的保健發(fā)揮一定的作用，所以無論在食品工業(yè)或是保健行業(yè)中都有著巨大的開發(fā)利用前景。

國內(nèi)外對于糖基化修飾，都集中在其反應(yīng)機理的研究，而對于如何通過修飾使其功能性質(zhì)在食品領(lǐng)域中得到充分應(yīng)用則是我們應(yīng)該專注的問題。目前在食品加工業(yè)中有很多優(yōu)良的蛋白急需開發(fā)，比如以低敏性聞名而適合嬰幼兒食用的大米蛋白，具有高生物價、高營養(yǎng)性能的乳清蛋白等。我們應(yīng)運用一系列優(yōu)化工藝，不僅使其營養(yǎng)性質(zhì)得到保存，還要在實際生產(chǎn)中提高其抗氧化活性，進而擴大各種蛋白質(zhì)在各領(lǐng)域中的應(yīng)用。

當然，對于抗氧化活性［40-41］的研究中，如何選擇合適的糖基供體優(yōu)化其抗氧化性能，并以其自然的，無害的產(chǎn)物來代替合成的抗氧化劑也是今后的研究重點。有研究已發(fā)現(xiàn)南瓜多糖具有優(yōu)良的抗氧化性［42］，如何將其應(yīng)用到實際中去修飾各種蛋白，進而提高抗氧化活性有待進一步研究。

［1］馬靜，葛熙，昌增益.蛋白質(zhì)功能研究:歷史，現(xiàn)狀和將來［J］.生命科學，2007，19(3):294-300.

［2］趙洪亮，劉志敏.蛋白質(zhì)糖基化工程［J］.中國生物工程雜志，2003(9):18-20.

［3］郭慧，鄧文星，張映，等.糖蛋白的研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2009(3):16-19.

［4］Ohtsubo K，Marth JD.Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease［J］.Cell，2006，126(5):855-867.

［5］王惠英，孫濤，周冬香，等.美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性能研究進展［J］.食品科技，2007(8):12-15.

［6］邱秀芹.自由基與抗氧化劑對人體健康的再評價［J］.實用醫(yī)技雜志，2007(32):4498-4500.

［7］凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2004.

［8］Veronika Somoza.The Maillard reaction in food and medicine［J］.Molecular Nutrition Food Research，2007，51(4):381-382.

［9］Sumaya-Martinez M T，Thomas S，Lenard B，et al.Effect of Maillard reaction conditions on browning and antiradical activity of sugar- tuna stomach hydro- lysate model system［J］.Food Research International，2005，38(8-9):1045-1050.

［10］王家紅，童玥，朱玥，等.蛋白質(zhì)糖基化的研究進展［J］.藥物生物技術(shù)，2011(1):77-80.

［11］Sean Munro. What can yeast tell us about N - linked glycosylation in the Golgi apparatus［J］.FEBS Letters，2001，498(2-3):223-227.

［12］Bektas M，Rubenstein David.The role of intracellular protein O- glycosylation in cell adhesion and disease［J］.Journal of Biomedical Research，2011(4):227-236.

［13］Wagner K H，Derk its S，Herr M，et al.Anti- oxidative potential of melanoidins isolated from a roasted glucose-glycine model［J］.Food Chemistry，2002，78:375-382.

［14］Cammerer B，Jalyschko W，Kroh L W.Intact carbohydrate structures as part of the melanoid in skeleton［J］.Agric Food Chem，2002，50(7):2083-2087.

［15］Brudzynski K，Miotto D.Honey melanoid ins:Analysis of the compositions of the high molecular weight melanoid ins exhibiting radical-scavenging activity［J］.Food Chemistry，2011，127(3):1023-1030.

［16］師成斌，張曉云，田艷花，等.黑麥芽類黑精體外抗氧化活性的研究［J］.食品工程，2007(01):56-59.

［17］王亞君，鄭群雄.丙烯酰胺與類黑精生成量的相關(guān)性及其體外代謝初探［D］.杭州:浙江工商大學，2009.

［18］Gu F L，Kim J M，Hayat K，et al. Characteristics and antioxidant activity of ultra filtrated Maillard reaction products from a casein-glucose model system［J］.Food Chemistry，2009，117(1):48-54.

［19］Osada Y，Shibamoto T.Anti-oxidative activity of volatile extracts from Maillard model systems［J］.Food Chemistry，2006，98(3):522-528.

［20］魯偉，黃筱茜，柯李晶，等.美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性研究［J］.食品與機械，2008(4):61-64.

［21］馬志玲，王延平，吳京洪.模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性能的研究［J］.中國油脂，2002，27(4):68-71.

［22］王惠英，孫濤，周冬香，等.殼聚糖的美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物的抗氧化性能研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(10):91-93.

［23］孔保華，李菁，劉騫.美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化機理及影響因素的研究進展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2011(1):9-13.

［24］孫麗平，莊永亮，汪東風.賴氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對銅離子的螯合作用［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(3):169-171.

［25］項惠丹，許時嬰，王璋.蛋白質(zhì)與還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性［J］.食品科學，2008(7):52-57.

［26］王惠英，孫濤，周冬香，等.L-賴氨酸與D-核糖的模式美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物抗氧化性能研究［J］.食品科學，2008(5):112-115.

［27］張曉溪，曾艷，張澤生，等.果糖與氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(6):175-178.

［28］王惠英，孫濤，周冬香，等.L-賴氨酸與葡萄糖美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物的抗氧化性能研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007(9):54-56.

［29］肖軍霞，黃國清，裴曉惠，等.不同模式體系美拉德反應(yīng)程度及抗氧化活性比較研究［J］.食品科學，2011(11):52-55.

［30］Hodge J E，Rist C E.The amadori rearrangement under new conditions and its significance for non - enzymatic browning reactions［J］. Journal of Agricultu and Food Chemisty，1953，75(2):316-322.

［31］Franakze C，Ivainsky H.Antioxidantt capacity of melanoid in［J］.Dtsch Lebensm-Rundsch，1954，50:251-254.

［32］萬素英，侯銀菊，李小六，等.美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性能研究［J］.中國食品添加劑，2005(6):47-49.

［33］田甜，段玉峰，牛付閣.覆盆子糖蛋白的抗氧化作用［J］.食品科學，2010(21):357-360.

［34］張瑛，侯凡凡，郭志堅.糖化/氧化修飾白蛋白對血管內(nèi)皮細胞ezrin 活化的調(diào)控及其機制研究［D］.廣州:南方醫(yī)科大學，2007.

［35］廖劍，殷正豐.糖蛋白質(zhì)組學分析肝癌相關(guān)血清糖蛋白巖藻糖基化異常［D］.上海:第二軍醫(yī)大學，2010.

［36］于汐洋，汪何雅，錢和.咸味香精中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(3):181-184.

［37］陳黎洪，唐宏剛，肖朝耿.金華火腿副產(chǎn)品酶解物的MRPs 抗氧化活性［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2011(6):1218-1223.

［38］張陸霞，管于平，姜瑋，等.鱈魚排蛋白水解及其營養(yǎng)風味型美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010(10):70-74.

［39］高宇，梁盈，林親錄，等.糖基化反應(yīng)改善大米蛋白功能特性的研究進展［J］.糧食工程，2012(30):62-65.

［40］李永富.美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化功能［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(32):13936-13937.

［41］嚴昊，付惠，謝冰.美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物抗氧化活性研究進展［J］.宜賓學院學報，2007(12):82-84.

［42］李俊麗，向長萍.南瓜水溶性多搪提取及抗氧化性能的研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2006，45(5):611-614.