鮑 蕾，呂 寧，吳振興，靜 平，許艷麗，江 帆，董 韜，果 旗，王 雄，* ，王 岳

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266002;2.北京中檢維康技術(shù)有限公司，北京100044;3.中國(guó)海洋大學(xué)，山東青島266100)

黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮經(jīng)常同時(shí)存在于農(nóng)作物如花生、玉米、棉籽、芝麻、核桃之中［1］，它們會(huì)發(fā)生致毒協(xié)同作用，植物油中有同時(shí)受到黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮污染的風(fēng)險(xiǎn)。中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)［2］規(guī)定花生油、玉米油中黃曲霉毒素B1不得超過(guò)20μg/kg，其它植物油黃曲霉毒素B1不得超過(guò)10μg/kg。歐盟［3］規(guī)定毛油和精煉植物油中的黃曲霉毒素B1不得超過(guò)2μg/kg，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量不得超過(guò)4μg/kg，精煉玉米油中玉米赤霉烯酮不得超過(guò)200μg/kg。鮑蕾等［4］應(yīng)用免疫親和柱凈化-光化學(xué)柱后衍生-高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測(cè)器測(cè)定了植物油中的黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2，隋凱等［5］應(yīng)用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法熒光法測(cè)定了玉米中的玉米赤霉烯酮，李軍等［6］應(yīng)用免疫親和柱同時(shí)凈化-高效液相色譜法測(cè)定了谷物中的黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮。免疫親和柱作為樣品前處理的方法能有效地將干擾物質(zhì)去除。采用免疫親和柱作為樣品前處理手段，減少了有機(jī)溶劑的使用和目標(biāo)分析物的損失，具有結(jié)合容量大、回收率高、洗脫條件溫和、可以方便地重復(fù)再生使用等優(yōu)點(diǎn)。本文應(yīng)用黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮多功能親和柱(IAC-AZ)同時(shí)凈化經(jīng)90%乙腈提取的植物油樣品，然后采用高效液相色譜法熒光法分別定量檢測(cè)了黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和玉米赤霉烯酮的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、玉米赤霉烯酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線值Table 1 Calibration curve values of aflatoxin B1，B2，G1，G2 and zearalenone standard solution

IAC-AZ 免疫親和柱 北京中檢維康技術(shù)有限公司，對(duì)黃曲霉毒素的柱容量為300ng，對(duì)玉米赤霉烯酮的柱容量為1200ng;甲醇、乙腈 色譜純，美國(guó)JT BAKER 公司;1.5μm 玻璃纖維濾紙 美國(guó)VICAM公司;黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國(guó)SUPLCO 公司;花生油、玉米油、芝麻油、調(diào)和油 從青島、北京市場(chǎng)購(gòu)得和企業(yè)贈(zèng)送。

高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器 型號(hào)L2000，日立公司;光化學(xué)衍生器 美國(guó)AURA INDUSTRIES 公司;多功能混合器 型號(hào)QB-206，海門(mén)市其林貝爾儀器公司;高速勻質(zhì)器 型號(hào)FSH-2，江蘇金壇榮華儀器公司。

1.2 液相色譜測(cè)定條件

測(cè)定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的液相色譜工作條件:色譜分析柱:Cloversil ODS-C18柱，5μm，4.6mm×250mm;流動(dòng)相:甲醇+ 水(45 +55，V/V);流速:1mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:25℃;熒光檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)360nm，發(fā)射440nm。

測(cè)定玉米赤霉烯酮的液相色譜工作條件:色譜分析柱:Cloversil ODS-C18柱，5μm，4.6mm ×250mm;流動(dòng)相:乙腈+ 甲醇+ 水(46 +46 +8，V/V/V);流速:1mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:25℃;熒光檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)274nm，發(fā)射440nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的提取 稱(chēng)取5.00g 樣品于50mL 離心管中，加入25mL 提取液乙腈+水(90 +10，V/V)，用多功能旋轉(zhuǎn)混合器混合10min(或者用人工用手劇烈振蕩3min，或用高速均質(zhì)器均質(zhì)1～2min)，用中速定性濾紙過(guò)濾，收集全部濾液。

1.3.2 免疫親和柱凈化 取濾液10mL，用40mL 純水液稀釋、混勻后用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，移取濾液20mL(相當(dāng)于0.8g 樣品)過(guò)IAC-AZ 免疫親和柱免疫親和柱，調(diào)節(jié)流速約1 ～2 滴/s，待溶液全部流出后，分別用10mL 的純水以約2～3 滴/s 清洗免疫親和柱，待溶液全部流出后。加入2mL 甲醇，調(diào)節(jié)流速約1～2 滴/s 的流速將免疫親和柱中的黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮洗脫下來(lái)。

1.3.3 液相色譜的測(cè)定 將上述洗脫液，在50℃氮?dú)庀麓蹈?，加?.8mL 50%甲醇水溶液，混勻，注入液相色譜儀中進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.2 的液相色譜測(cè)定條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表1。

應(yīng)用液相色譜計(jì)算軟件，以基線噪聲10 倍峰面積對(duì)應(yīng)的峰面積對(duì)應(yīng)的五種毒素的含量作為定量限的規(guī)則(S/N =10)，得出黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量限均為0.1μg/kg，玉米赤霉烯酮的定量限為5.0μg/kg。五種毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R 均大于0.9999，結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.1～25.0ng/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系;玉米赤霉烯酮在5.0 ～200.0ng/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 準(zhǔn)確性和重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度測(cè)定。在空白樣品中(調(diào)和油)分別添加黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、玉米赤霉烯酮三個(gè)濃度水平，然后進(jìn)行5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2 中回收率及精密度數(shù)據(jù)可以看出，本方法測(cè)定黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2回收率數(shù)據(jù)全部在82.0%～91.0%之間，室內(nèi)三個(gè)水平添加五次重復(fù)的變異系數(shù)在10.4%以內(nèi)。測(cè)定玉米赤霉烯酮回收率數(shù)據(jù)在83.7%～95.5%之間，室內(nèi)三個(gè)水平添加五次重復(fù)的變異系數(shù)在7.9%以內(nèi)?；緷M足了定量檢測(cè)對(duì)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求。

免疫親和柱的高度選擇性使樣品前處理大為簡(jiǎn)化，本實(shí)驗(yàn)中用90%乙腈水提取，植物油中的黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，提取液用純水稀釋5 倍后，經(jīng)過(guò)免疫親和柱凈化，用水稀釋的目的是減小有機(jī)溶劑乙腈對(duì)免疫親和柱的親和力的干擾。然后用10mL 純水淋洗親和柱，去除非特異性吸附雜質(zhì)。最后用2mL 甲醇將特異性吸附的黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮洗脫到甲醇中。目標(biāo)分析物得到分離純化與富集，避免了提取液中干擾物質(zhì)HPLC 測(cè)定的影響(色譜峰中除了樣品峰和溶劑峰外，沒(méi)有其它雜峰)，凈化效果見(jiàn)圖1、圖2。

2.3 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

花生油、玉米油、芝麻油、調(diào)和油各采集5 份共20個(gè)樣本，分別進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)有三個(gè)花生油樣品黃曲霉毒素總量分別為7.9、4.5 和3.8μg/kg，有1 個(gè)芝麻油樣品中檢測(cè)出黃曲霉毒素總量含量為3.5μg/kg，花生油和芝麻油中均未檢出玉米赤霉烯酮。玉米油有2 個(gè)樣本中檢出有黃曲霉毒素，總量分別為2.7、7.8μg/kg，但所有樣本均檢出有玉米赤霉烯酮，含量為49.0～507.0μg/kg。調(diào)和油有1 個(gè)樣品中檢測(cè)出黃曲霉毒素總量含量為2.6μg/kg，3 個(gè)樣本中檢出有玉米赤霉烯酮，含量分別為10.6、27.2、49.5μg/kg。

表2 準(zhǔn)確性和重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The accuracy and repeatability of the results

圖1 花生油樣品的免疫親和柱凈化-HPLC 法檢測(cè)黃曲霉毒素的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of aflatoxins in peanut oil cleaning up by immunoaffinity column

圖2 玉米油樣品的免疫親和柱凈化-HPLC 法檢測(cè)玉米赤霉烯酮的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of zearalenone in corn oil cleaning up by immunoaffinity column

3 結(jié)論

免疫親和柱作為樣品前處理的方法是利用抗原抗體的高度特異性來(lái)進(jìn)行樣品的分離純化與富集的，因此能有效地將干擾物質(zhì)去除。采用免疫親和柱作為樣品前處理手段，減少了有機(jī)溶劑的使用和目標(biāo)分析物的損失，具有結(jié)合容量大、回收率高、洗脫條件溫和、可以方便地重復(fù)再生使用等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)很好的將免疫親和柱技術(shù)應(yīng)用到植物油中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和玉米赤霉烯酮的測(cè)定。減少了乙腈的使用，提高了樣品的凈化效果，并滿足了定量檢測(cè)對(duì)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求。

免疫親和柱同時(shí)凈化-高效液相色譜法熒光法檢測(cè)了植物油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法的定量限分別為0.1μg/kg，玉米赤霉烯酮的方法的定量限分別為5.0μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10.4%，回收率為82.0%～95.5%，其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟［7］和中國(guó)［8］對(duì)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和玉米赤霉烯酮定量分析方法標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求:回收率70%～110%，CV 小于21%。該方法可以簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可以用于對(duì)植物油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和玉米赤霉烯酮進(jìn)行快速定量檢測(cè)。

［1］張藝兵，鮑蕾，褚慶華.農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)分析［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:1-42.

［2］對(duì)(EC)No 1881/2006 條例中食品中黃曲霉毒素的最大限量值的修訂［S］.歐盟(EU)條例，(EU)No 165/2010。

［3］食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量［S］.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，GB 2761-2011.

［4］Bao L，Trucksess MW，White KD.Determination of aflatoxins B1，B2，G1，and G2 in olive oil，peanut oil，and sesame oil［J］.J AOAC Int，2010，93(3):36-42.

［5］隋凱，李軍，衛(wèi)鋒，等.免疫親和柱-高效液相色譜法檢測(cè)玉米中的玉米赤霉烯酮［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006(6):22-23.

［6］李軍，于一茫，田苗，等.免疫親和柱凈化-柱后光化學(xué)衍生-高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A［J］.色譜雜志，2006，24(6):581-584.

［7］Food analysis-Biotoxins-Criteria of analytical methods of mycotoxins［S］.CEN(European Committee for Standardization)，CR 13505-1999.

［8］出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留物及生物毒素檢驗(yàn)方法編寫(xiě)的基本規(guī)定［S］.中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SN/T 0001-1995.