馬榮山，王宜琦，* ，婁 怡，劉志會，張祖奎，馬千里

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866;2.遼寧建平福澤酒業(yè)有限公司，遼寧朝陽122400)

沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.)，又稱醋柳、黃酸刺、酸刺柳、黑刺、酸刺，是被子植物門雙子葉植物綱薔薇目胡頹子科沙棘屬，沙棘是一種落葉性灌木，對土壤適應(yīng)性強(qiáng)，是防風(fēng)固沙，保持水土，改良土壤的優(yōu)良樹種。其果實(shí)吸取天地精華，含有豐富的VC、VE、VD、VB1、黃酮、氨基酸、有機(jī)酸及其它人體所需微量元素［1］，其中尤以黃酮、VC含量較其它水果之冠［2-3］。我國沙棘資源十分豐富，但由于沙棘本身味道較酸，口感較差，直接食用難以被人們所接受，所以沙棘果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收益不是很好，每年有大量的沙棘被浪費(fèi)掉了，而沙棘果酒的發(fā)展能夠帶動地方經(jīng)濟(jì)、生態(tài)、產(chǎn)業(yè)等效益的發(fā)展，并且符合當(dāng)今美容保健的消費(fèi)趨勢［4-5］。流加發(fā)酵法是以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的一種發(fā)酵方法。由于酵母菌的最適糖度為12%，過高的糖環(huán)境不利于酵母菌的生長及發(fā)酵［6］，然而在發(fā)酵過程中12%的糖度較低，又不足以滿足酵母菌的需求，生產(chǎn)出的果酒中酒精體積分?jǐn)?shù)低，糖度過量又會導(dǎo)致殘?zhí)沁^高影響果酒品質(zhì)，因此采用流加發(fā)酵方法來解決這個(gè)問題［7-8］，而且流加發(fā)酵使得酵母菌代謝發(fā)生變化，發(fā)酵更加完全，有利于果酒香氣的呈現(xiàn)和溢出，營養(yǎng)健康、果香醇厚的消費(fèi)飲品符合目前市場需求，長期飲用可以達(dá)到保健的目的，而目前對于流加發(fā)酵法生產(chǎn)沙棘果酒的相關(guān)研究尚未見報(bào)［9-10］。為此本實(shí)驗(yàn)旨在采用流加發(fā)酵方法而得到香氣醇正、酒精體積分?jǐn)?shù)較高的沙棘果酒，以期對沙棘深加工產(chǎn)品的開發(fā)研究提供一定的理論依據(jù)。

表1 沙棘果酒感官指標(biāo)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standard of the sensory perception index of Seabuckthorn wine

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘汁 遼寧建平福澤酒業(yè)有限公司;飴糖 沈陽科新食品添加劑有限公司生產(chǎn);碳酸鉀 AR;果膠酶 河南鄭州雅大生物工程股份有限公司(酶活5000U/mL);偏重亞硫酸鈉 AR;酵母 安琪牌葡萄酒高活性干酵母。

數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6) 國華電器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠;101-1A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;酒精計(jì) 河北省河間市儀表廠;手持糖度儀 成都光學(xué)廠;PHS-25C 型精密pH 計(jì) 上?？祪x儀器有限公司;7890GC/5975MS(氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀) 美國Agilent公司;PDMS 萃取頭、手動SPME 進(jìn)樣器 美國Supelco 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)［11］取1000mL 沙棘果汁，用濃度為75%的飴糖調(diào)整糖度、K2CO3調(diào)整酸度后，向其中加入0.3%的果膠酶，用以除去其中果膠物質(zhì)，來提高沙棘果酒穩(wěn)定性，再向其中加入偏重亞硫酸鈉來除去雜菌，經(jīng)過65℃的巴氏滅菌30min 后，接入活化好的酵母菌1‰，在18℃下發(fā)酵10d，加入2%的硅藻土以吸附其中的酵母細(xì)胞及懸垂的蛋白質(zhì)等。沙棘汁的固形物含量為9%，酸度為19g/L。

酶解:由于沙棘果汁中含有蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)，影響沙棘果酒的穩(wěn)定性，而加熱處理溫度高易導(dǎo)致沙棘汁色澤加深、苦澀味加重、破壞營養(yǎng)成分，故采用果膠酶來處理其中的果膠，并且酶解還具有提高出汁率的作用。

沙棘果酒采用低溫發(fā)酵，在成酒過程中能產(chǎn)生較多的高碳有機(jī)酸酯，是產(chǎn)香的主要來源，且低溫發(fā)酵能較好的保持原汁中的果香。

氣相色譜條件:Agilent 毛細(xì)管色譜柱DB1701 彈性石英毛細(xì)管柱(30m ×0.25mm，0.25μm)，進(jìn)樣口溫度250℃，程序升溫:初始溫度80℃，保持5min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min 升至270℃，保持5min。

質(zhì)譜條件:電離方式EI，70eV，離子源溫度:230℃，質(zhì)量掃描范圍:35～400amu，發(fā)射電流100μA，檢測電壓1.4kV，對采集到的質(zhì)譜圖利用NIST02 譜庫進(jìn)行檢索。

1.2.3 主要測定方法 pH:pH 計(jì)法;還原糖:3，5-二硝基水楊酸比色法;固形物含量:折光儀;酒精體積分?jǐn)?shù):蒸餾法;酸度:滴定法;香氣成分:氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在上述條件保持不變的情況下，分別考察初始糖度、流加糖時(shí)間、流加糖量對于酒的體積分?jǐn)?shù)的影響。流加糖的時(shí)間為2～8d;流加次數(shù)為1～4 次;流加量為20～40mL。發(fā)酵過程每天測還原糖含量，至還原糖含量變化不大時(shí)結(jié)束發(fā)酵，確定發(fā)酵時(shí)間，測定發(fā)酵液最終酒精體積分?jǐn)?shù)并進(jìn)行感官評定。

1.3.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)模型，選擇初始糖度、流加糖時(shí)間、流加糖量作為影響因素，以酒的體積分?jǐn)?shù)作為響應(yīng)值，采用3 因素3 水平的響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，利用Mintanb15 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素及水平表Table 2 Variables and levels in Box-Behnken central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

由表3 可以看出，在發(fā)酵第3、4、5、6、7、8d 流加相同量的糖，酒精體積分?jǐn)?shù)都有所提高。發(fā)酵前2d酵母處于增殖階段，消耗還原糖少，此時(shí)加糖會加大發(fā)酵液的滲透壓，不利于酵母菌的生長繁殖，酒精體積分?jǐn)?shù)比第3～6d 流加糖的酒精體積分?jǐn)?shù)較低，殘?zhí)橇枯^高。第7、8d 流加糖，此時(shí)處于發(fā)酵后期，酵母大多數(shù)已經(jīng)老化死亡，此時(shí)加糖，酵母利用糖不充分，使發(fā)酵液殘?zhí)沁^高，酒精體積分?jǐn)?shù)低。發(fā)酵第3～6d流加糖，此時(shí)處于發(fā)酵旺盛階段，酵母活性高，發(fā)酵劇烈，此時(shí)加糖對提高酒精體積分?jǐn)?shù)效果顯著。

由表4 可以看出，較一次流加糖，分次流加的酵母菌對還原糖的利用較充分，酒精體積分?jǐn)?shù)有所提高。在第3、4、5d 流加糖效果最好，酒精體積分?jǐn)?shù)最高，流加后發(fā)酵劇烈，酒質(zhì)較好。

表3 不同流加糖時(shí)間的發(fā)酵結(jié)果比較Table 3 Comparison of fermentation with different fed time of caramel

表4 不同流加次數(shù)的發(fā)酵結(jié)果比較Table 4 Comparison of fermentation with different rates of adding

由表5 可以看出，當(dāng)流加糖為20mL 時(shí)，糖添加量不夠，酒精體積分?jǐn)?shù)較低。流加糖量為30mL 時(shí)，效果最明顯，酒精體積分?jǐn)?shù)最高。當(dāng)流加糖量為40mL 時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)較高，但殘?zhí)橇扛撸€原糖不能充分利用，得到的果酒口味協(xié)調(diào)純正，酸甜適中。因此選擇糖流加量為25～35mL。

表5 不同糖流加量的發(fā)酵結(jié)果比較Table 5 Comparison of fermentation with different amount of caramel

2.2 擬合模型的建立及方差分析

應(yīng)用Minitab 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，回歸方程為

表6 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Box-Behnken experiment design and results

從表7 可以看出，回歸性表現(xiàn)極顯著，其中線性、平方、交互作用模型的顯著水平均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，表現(xiàn)極顯著。失擬項(xiàng)大于0.05 不顯著，表明該方程與實(shí)驗(yàn)擬合較好，該響應(yīng)模型適用于本次實(shí)驗(yàn)，可以反映出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance of the developed regression equation

從表8 可以看出，方程中的X1、X3、X12、X1X2、X2X3極顯著，X32顯著，X2、X1X3、X22不顯著，其影響強(qiáng)弱依次為X2X3、X1X2、X1、X12、X3、X32、X1X3、X2、X22，表明各個(gè)影響因素與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系。

表8 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 8 The significant test of regression coefficients

2.2 響應(yīng)面圖形分析

由圖1 可知，酒精的體積分?jǐn)?shù)受初始糖度和流加天數(shù)的交互作用影響，當(dāng)流加天數(shù)為3、4、5d 時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨初始糖度增大而增大;當(dāng)流加天數(shù)為3、4、5、6d 時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨初始糖度增大而呈先增大后減小趨勢。當(dāng)初始糖度為10%時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨流加天數(shù)增大而增大;當(dāng)初始糖度為12%時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨流加天數(shù)增大而減小。所以，當(dāng)初始糖度處于較高水平，流加天數(shù)處于較低水平時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)相對較高。

圖1 酒精體積分?jǐn)?shù)與初始糖度、流加天數(shù)的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface for alcohol concentration under initial caramel and fed-batch fermentation time

由圖2 可知，當(dāng)流加糖量為25mL 時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨初始糖度增大而增大，后期變化較小;當(dāng)流加糖量為35mL 時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨初始糖度增大而呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)初始糖度為10%時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨流加糖量增大而增大;當(dāng)初始糖度為12%時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨流加糖量增大而呈先增大后減小趨勢，但變化不大。

圖2 酒精體積分?jǐn)?shù)與初始糖度、流加糖量的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface for alcohol concentration under initial caramel and caramel inoculating amount

由圖3 可知，酒精體積分?jǐn)?shù)受流加天數(shù)與流加糖量共同作用的影響，當(dāng)流加糖量為25mL 時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨流加天數(shù)增大而增大;當(dāng)流加糖量為35mL 時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨流加天數(shù)增大而減小。當(dāng)流加天數(shù)為較低水平時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨流加糖量增大而增大，且變化值非常大;當(dāng)流加天數(shù)為較高水平時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨流加糖量增大而減小，但變化較小。故當(dāng)流加天數(shù)取較低水平，流加糖量取較高水平時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)相對高，這與酵母代謝密切相關(guān)。

圖3 酒精體積分?jǐn)?shù)與流加天數(shù)、流加糖量的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface for alcohol concentration under fed-batch fermentation time and caramel inoculating amount

2.3 流加工藝優(yōu)化及驗(yàn)證

通過Minitab 軟件的響應(yīng)優(yōu)化器得到了最優(yōu)工藝:初始糖度為11.8%、流加時(shí)間為3d +4d +5d、流加糖量為35mL，編碼值分別為0.8182、-1、1，預(yù)測酒精體積分?jǐn)?shù)結(jié)果為11.7833%。驗(yàn)證該結(jié)果做三次平行實(shí)驗(yàn)，酒精體積分?jǐn)?shù)平均為11.9%，酸度達(dá)6.5g/L，糖度1.1%，酒的體積分?jǐn)?shù)較高，酸度較低，殘?zhí)橇康蛶捉拇M，達(dá)到了優(yōu)化流加工藝的目的。其中調(diào)整糖度加入了25mL 飴糖，流加總糖加入105mL，共加入飴糖130mL。

相同條件下做未流加發(fā)酵的沙棘果酒，加入130mL 飴糖，糖度調(diào)整至19%，發(fā)酵至終，得到酒精體積分?jǐn)?shù)為11.0%的沙棘果酒，酸度達(dá)6.8 g/L，糖度達(dá)3.2%。

2.4 流加發(fā)酵與非流加發(fā)酵的沙棘果酒香氣分析

2.4.1 香氣成分質(zhì)譜分析總離子色譜圖 由于本實(shí)驗(yàn)僅意圖比對流加與未流加兩種發(fā)酵工藝生產(chǎn)的沙棘果酒香氣，故未用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行實(shí)際定量，采用頂空固相微萃取法，流加與未流加發(fā)酵的果酒均在相同條件下進(jìn)行香氣測定。其總離子流圖見圖4、圖5。

圖4 流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)的沙棘果酒的香氣成分總離子色譜圖Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of flavor components in Hippophae rhamnoides wine through the Fed-batch fermentation process

圖5 非流加發(fā)酵生產(chǎn)的沙棘果酒的香氣成分總離子色譜圖Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of flavor components in Hippophae rhamnoides wine not through the Fed-batch fermentation process

2.4.2 流加發(fā)酵與非流加發(fā)酵生產(chǎn)的沙棘果酒香氣成分及相對含量分析 由圖4、圖5 可知，本實(shí)驗(yàn)中鑒定出匹配度在80 以上的香氣成分有酯類、醇類、酸類、烷烴和芳香族化合物。未經(jīng)流加發(fā)酵生產(chǎn)的沙棘果酒中檢測出15 種香氣成分，其中含量較高的為酯類(40.50%)、醇類(12.00%)、酸類(8.16%)、烷烴(3.82%)，而經(jīng)過流加發(fā)酵的沙棘果酒中檢測出22 種，其中含量較高的有酯類(52.31%)、醇類(12.04%)、酸類(7.80%)、烷烴(4.28%)，還有芳香族化合物(2.05%)。

酯類物質(zhì)是影響果酒香氣的重要成分，它們除來源于果實(shí)本身外，大部分來自于發(fā)酵的過程，在未流加的沙棘果酒中酯類檢測出7 種，其中含量最高的辛酸乙酯，其次是己酸乙酯，流加發(fā)酵的沙棘果酒有9 種，其中含量最高的為辛酸乙酯，其次為2-苯基-醋酸乙酯，流加發(fā)酵比較未流加發(fā)酵的沙棘果酒，無論酯類的種類、相對含量和峰面積，前者均高于后者。適量的醇類可以賦予果酒濃郁芬芳的感官特性，但含量過高，則會產(chǎn)生不愉快的味道，兩者的醇類均為苯乙醇和2，3-丁二醇，苯乙醇含量較高。酸類均為癸酸和辛酸，流加發(fā)酵的較未流加的酸類含量略低，沙棘果本身味酸，酸度過高影響口感。未流加果酒的烷烴為1-甲氧基-3-甲基-丁烷，流加的果酒烷烴為2，3，4-三甲基戊烷和3-乙氧基-甲基三(三甲基硅氧烷基)硅烷。芳香族化合物在果酒中含量少，但其香味特點(diǎn)突出，能夠賦予酒體醇厚的風(fēng)味，流加發(fā)酵的果酒中含有4-乙基苯酚和異丙酚，而未流加的果酒中未檢出芳香族化合物。

香味呈現(xiàn)的作用機(jī)制非常復(fù)雜，它不僅僅和發(fā)酵原料有關(guān)，更與酵母的代謝過程息息相關(guān)，流加發(fā)酵相比未流加發(fā)酵生產(chǎn)的沙棘果酒，果香較濃郁、口感較醇厚、酸味較低、后味更重。

3 結(jié)論

3.1 采用響應(yīng)曲面來確定最佳沙棘果酒的流加工藝，初始糖度為11.8%、流加時(shí)間為3d+4d+5d，流加糖量為35mL，預(yù)測酒精體積分?jǐn)?shù)可達(dá)11.7833%，實(shí)際考察得到平均酒精體積分?jǐn)?shù)為11.9%的沙棘果酒，而未流加發(fā)酵生產(chǎn)的果酒的酒精體積分?jǐn)?shù)僅為11.0%。

3.2 采用GC-MS 分析測定流加發(fā)酵與未流加發(fā)酵的沙棘果酒的香氣成分，分別鑒定出匹配度大于80的香氣種類有22 種和15 種，其中前者的酯類有9種，后者有7 種，前者峰面積較高;二者的醇類物質(zhì)均為2 種;酸類物質(zhì)均為2 種，流加較未流加峰面積低，物質(zhì)濃度低;烷烴類前者含2 種，后者含1 種;芳香族化合物前者測出2 種，而后者無。表明流加發(fā)酵對于沙棘果酒的酒體積分?jǐn)?shù)有所提高，殘?zhí)堑?，香氣有所改善，而香氣的產(chǎn)生機(jī)理及各種香氣之間的作用機(jī)制的這一方面研究還有待于深入探索。

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