王程程，趙 玲，李敏通，王蓉暉，李延斌，胡耀華，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院，陜西楊凌712100;2.阿肯色大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程系，美國(guó)阿肯色費(fèi)耶特維爾72701)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是最常見(jiàn)的食物中毒病原菌之一，廣泛存在于自然界中，如空氣，水，人和動(dòng)物的排泄物等，因此，食品很易受其污染［1-2］。金黃色葡萄球菌呈革蘭氏陽(yáng)性，可分泌多種毒性蛋白質(zhì)，其分泌的金黃色葡萄球菌腸毒素可引起人類胃腸性多種疾?。?］。在美國(guó)，由其引起的食物中毒居第二位，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，在加拿大占45%［4］，我國(guó)每年此類中毒事件也屢有發(fā)生，金黃色葡萄球菌污染及其腸毒素已是世界性衛(wèi)生問(wèn)題［5-6］。傳統(tǒng)檢測(cè)病原微生物的方法步驟較繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，在低濃度菌量下易出現(xiàn)漏檢，多數(shù)免疫學(xué)檢測(cè)所需成本高且耗時(shí)，對(duì)樣品要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理［7］，難以滿足食品安全事件中快速準(zhǔn)確的檢測(cè)需求。免疫磁珠(Immunomagnetic Beads，IMBs)具有選擇性好，特異性強(qiáng)，能將目標(biāo)菌從復(fù)雜的食品基質(zhì)中快速分離出來(lái)，起到快速分離、富集細(xì)菌的作用［8］。目前，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者利用免疫磁珠與其他檢測(cè)方法結(jié)合，如酶聯(lián)免疫法，PCR，量子點(diǎn)熒光檢測(cè)等對(duì)沙門氏菌［9-12］，大腸桿菌［13-14］，李斯特菌［15-17］，阪崎桿菌［18］等多種食源性微生物進(jìn)行檢測(cè)研究，利用免疫磁珠對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)尚處于探索階段［19］。本研究擬利用生物素化的金黃色葡萄球菌多抗包被鏈酶親和素磁珠制備免疫磁珠，對(duì)金黃色葡萄球菌免疫捕獲，結(jié)合傳統(tǒng)平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化建立基于免疫磁分離技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌的快速分離方法，并利用該方法捕獲人工污染該菌的羊肉卷洗水樣品，驗(yàn)證該方法用于食品樣品的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC27660) 由上?；墼派锟萍加邢薰咎峁?福氏志賀氏菌(ATCC12022) 購(gòu)于美國(guó)菌種保藏所;冷凍羊肉卷(內(nèi)蒙古草原興發(fā)) 購(gòu)自楊凌好又多超市;鏈霉親和素磁珠(180nm，2mg/mL) 購(gòu)于江陰美英特公司;生物素化兔抗金葡菌多克隆抗體(4～5mg/mL) 購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司;Baird-Parker 培養(yǎng)基基礎(chǔ)、亞碲酸鉀卵黃增菌劑、LB 肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 均購(gòu)于北京陸橋;PBS 緩沖液 購(gòu)于Sigma 公司;牛血清蛋白 購(gòu)于沃爾森公司。

納米磁分離器MS0206 購(gòu)于江陰美英特公司;智能恒溫恒濕箱HWS-250 購(gòu)于海曙賽福儀器廠;漩渦混合器VORTEX-5、旋轉(zhuǎn)搖床QB-210 均購(gòu)于其林貝爾公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫磁珠的制備

1.2.1.1 磁珠與多抗的偶聯(lián) 分別取1.0mL(即2mg)的鏈霉親和素磁珠5 份于離心管中，用1.0mL的PBS(0.01mol/L，pH 7.4，后面均相同)清洗三遍，棄去清洗液，向其中分別加入10、30、50、70、100μL的生物素化兔抗金黃色葡萄球菌多抗(4～5mg/mL)后，向其中分別依次加入PBS 緩沖液490、470、450、430、400μL(保證混合液體積在500μL，這樣可充分振蕩均勻)，室溫下(28℃左右)以15r/min 振蕩30min［15-16］。置于納米磁分離器(0.4T)中，磁分離1.5min 使磁珠充分吸附后，吸去試管中的液體，再加入1.0mL PBS 清洗三遍后，用1.0mL PBS 重新分散磁珠。

1.2.1.2 免疫磁珠的封閉 磁分離上述免疫磁珠，去除液相后，取1mL 1% BSA 的PBS 緩沖液加入各管中，封閉振蕩(15r/min)1h 后，磁分離用PBS 徹底清洗三次。加入1.0mL 的PBS 重新分散免疫磁珠，并標(biāo)記為IMB-10、IMB-30、IMB-50、IMB-70、IMB-100，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫捕獲金黃色葡萄球菌條件優(yōu)化

1.2.2.1 多克隆抗體包被鏈霉親和素磁珠加入量的優(yōu)化選取 分別取IMB-10、IMB-30、IMB-50、IMB-70、IMB-100 各60μL，加入到1.5mL 離心管中，磁分離后，加入菌懸液500μL，同時(shí)作只加入500μL菌懸液的陽(yáng)性對(duì)照，在室溫下以15r/min 振蕩孵育45min，置于納米磁分離器中，磁分離1.5min 使磁珠充分吸附后，吸出廢液收集，用PBS 清洗兩遍，收集洗液，廢液和洗液混合于1.5mL 離心管中，IMB-菌復(fù)合物重新分散在1.0mL PBS 中。將陽(yáng)性對(duì)照，IMB-菌懸液，廢液按10 倍梯度稀釋至103或102CFU/mL，分別取100μL 在Baird-Parker 平板上鋪盤，平行三次鋪盤。參考GB 4789.10-2010 將涂布好的平板在37℃培養(yǎng)45～48h 后計(jì)數(shù)。

計(jì)算捕獲效率:W(%)=Nb/N0×100

式中:W-免疫磁珠對(duì)金黃色葡萄球菌的捕獲效率(%);Nb-免疫磁珠捕獲到的金黃色葡萄球菌細(xì)菌數(shù)(CFU);N0-陽(yáng)性對(duì)照中金黃色葡萄球菌細(xì)菌總數(shù)(CFU)。

1.2.2.2 免疫磁珠加入量的優(yōu)化選取 取免疫磁珠IMB-50，加入量分別為20、40、60、80、100μL 于5 個(gè)1.5mL 離心管中，具體操作同上，振蕩反應(yīng)45min，磁分離后平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。

1.2.2.3 免疫捕獲時(shí)間的優(yōu)化選取 取4 份60μL 免疫磁珠IMB-50，具體操作同上，分別和菌懸液振蕩反應(yīng)20、45、70、95min，磁分離后平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。

1.2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用L9(34)正交表，以抗體加入量，免疫磁珠加入量，免疫捕獲時(shí)間為考察因素，進(jìn)行4 因素3 水平(設(shè)一空列)的正交實(shí)驗(yàn)，選取濃度為103CFU/mL 菌液進(jìn)一步優(yōu)化免疫磁捕獲的條件。因素水平表如表1 所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The table of levels and factors to orthogonal test

1.2.3 免疫磁珠對(duì)不同濃度菌液的捕獲 將1mL 的金黃色葡萄球菌凍存液加入到9mL 滅菌LB 肉湯，混合均勻，37℃培養(yǎng)20h，用PBS 10 倍梯度稀釋，選取103、104、105、106CFU/mL 的菌懸液，按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的捕獲條件對(duì)以上濃度的菌懸液捕獲，參照方法1.2.2.1，重復(fù)3 次，計(jì)算捕獲效率，檢驗(yàn)優(yōu)化出的捕獲條件是否可行。

1.2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn) 選取100、101、102CFU/mL 的菌懸液，在最佳免疫捕獲條件下，參照方法1.2.2.1 進(jìn)行捕獲、磁分離。將陽(yáng)性對(duì)照，IMB-菌懸液，廢液以0.3、0.3、0.4mL 分別在Baird-Parker 平板鋪盤，將涂布好的平板在37℃培養(yǎng)45～48h 后計(jì)數(shù)。

1.2.5 特異性實(shí)驗(yàn) 將均含有103CFU/mL 的金黃色葡萄球菌和福氏志賀氏菌的混合液加入到免疫磁珠中，同時(shí)作陽(yáng)性對(duì)照，在室溫下以15r/min 振蕩孵育45min，磁分離1.5min 后，用PBS 清洗兩遍，收集洗液，廢液和洗液混合于1.5mL 離心管中，IMB-菌復(fù)合物重新分散在1.0mL PBS 中。將陽(yáng)性對(duì)照，IMB-菌懸液，廢液分別取100μL 同時(shí)在BP 平板和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上涂布，37℃培養(yǎng)45～48h 后觀察計(jì)數(shù)。

1.2.6 免疫磁分離食品樣品中金黃色葡萄球菌 準(zhǔn)確稱取25g 冷凍羊肉卷，加入225mL 0.1%無(wú)菌PBS于三角瓶中，混合攪拌1min，收集洗水，各取9mL 洗水于無(wú)菌試管中，分別接入1mL 不同濃度的金黃色葡萄球菌懸液，選擇菌液濃度在102和103CFU/mL的樣品，同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)，按上述方法免疫磁捕獲，BP 平板菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫捕獲金黃色葡萄球菌條件優(yōu)化

2.1.1 多克隆抗體包被鏈霉親和素磁珠加入量的優(yōu)化選取 如圖1 所示，當(dāng)加入的抗體量在10～30μL時(shí)，隨著抗體加入量的增加捕獲效率增大，隨后，隨著抗體加入量增加捕獲效率反而逐漸下降，并趨于平緩。原因是過(guò)量抗體的加入會(huì)導(dǎo)致空間阻礙和競(jìng)爭(zhēng)，即便有更多數(shù)量的抗體附著在磁珠上，其連接的穩(wěn)定程度遠(yuǎn)不如適量抗體與磁珠的結(jié)合，在接下來(lái)的磁珠分離和洗脫步驟中，結(jié)合不太緊的抗體會(huì)與磁珠再分離，導(dǎo)致捕獲效率反而下降?？梢?jiàn)添加的抗體量過(guò)多不僅不利于反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)也造成抗體的浪費(fèi)，故初選30μL 抗體加入量的免疫磁珠。

圖1 多抗包被鏈霉親和素磁珠加入量對(duì)金黃色葡萄球菌捕獲效率的影響Fig.1 The effect of addition amount of antibody coating the magnetic beads on capture efficiency of SA

2.1.2 免疫磁珠加入量的優(yōu)化選取 如圖2 所示，隨著免疫磁珠加入量增加，金黃色葡萄球菌捕獲效率逐漸增大，當(dāng)免疫磁珠加入量達(dá)到80μL 時(shí)，捕獲效率達(dá)到相對(duì)最大，再繼續(xù)增加捕獲效率反而降低，可能是由于免疫磁珠過(guò)多后，細(xì)菌表面吸附的磁珠量增大，這樣在強(qiáng)磁場(chǎng)下分離時(shí)造成部分細(xì)菌損傷，從而造成捕獲效率有所下降，故初選用80μL 作為免疫磁珠的最佳加入量。

圖2 免疫磁珠加入量對(duì)金黃色葡萄球菌捕獲效率的影響Fig.2 The effect of addition amount of IMB on capture efficiency of SA

2.1.3 免疫捕獲時(shí)間的優(yōu)化選取 如圖3 所示，免疫捕獲時(shí)間在20 ～45min 時(shí)，捕獲效率隨時(shí)間延長(zhǎng)增大，當(dāng)捕獲時(shí)間為45min 時(shí)，免疫磁珠對(duì)金黃色葡萄球菌的捕獲效率相對(duì)最高，45～95min 之間捕獲效率緩慢下降并趨于平緩。原因是免疫捕獲時(shí)間過(guò)短，細(xì)菌與免疫磁珠結(jié)合不充分，造成免疫磁珠沒(méi)有充分捕獲到目標(biāo)菌，或者細(xì)菌和磁珠結(jié)合的穩(wěn)定程度還不高，在后續(xù)的磁珠分離、洗脫步驟中再分離，因而捕獲效率較低，又由于整個(gè)反應(yīng)過(guò)程始終是在振蕩條件下進(jìn)行的，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能使部分細(xì)菌與磁珠脫離，捕獲效率略有下降。因此，初選免疫捕獲時(shí)間為45min。

圖3 免疫捕獲時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌捕獲效率的影響Fig.3 The effect of response time on capture efficiency of SA

2.1.4 免疫捕獲的正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用L9(34)正交表，進(jìn)行4 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)(設(shè)一列空列)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果Table 2 The results of range analysis to orthogonal test

從表2 可以看出，各因素的影響次序是A ＞C ＞B，即依次是抗體包被磁珠的加入量、免疫捕獲時(shí)間和免疫磁珠加入量，同時(shí)，各因素的極差值均大于空列的極差值，說(shuō)明各因素在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)均有明顯影響。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出最佳的免疫磁捕獲條件為抗體包被磁珠加入量為30μL，免疫磁珠加入80μL，與菌液免疫捕獲時(shí)間為45min。

2.2 免疫磁珠對(duì)不同濃度菌液的捕獲

為了進(jìn)一步驗(yàn)證最佳條件，同時(shí)檢驗(yàn)免疫磁珠捕獲效率的穩(wěn)定性，在最佳免疫捕獲條件下，對(duì)103、104、105、106CFU/mL 的菌液捕獲效率如表3 所示。結(jié)果顯示，免疫磁珠對(duì)103～106CFU/mL PBS 中的金黃色葡萄球菌捕獲效率在33.50%到40.17%之間，捕獲效率基本都高于正交表中的最優(yōu)組合，說(shuō)明優(yōu)化出的條件可行。

同時(shí)，免疫磁珠對(duì)不同濃度菌液的捕獲效率相對(duì)比較穩(wěn)定，這為后期免疫磁珠分離技術(shù)和其他檢測(cè)方法相結(jié)合定量檢測(cè)，獲得線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線提供了基礎(chǔ)。

表3 免疫磁珠對(duì)不同濃度金黃色葡萄球菌的捕獲Table 3 The capture of IMB to different concentration SA in PBS

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

從表4 可以看出，這種免疫磁捕獲金黃色葡萄球菌的方法可以捕獲到101CFU/mL 濃度的菌液，表明該方法有較高的靈敏度。

表4 免疫磁珠捕獲的靈敏度實(shí)驗(yàn)Table 4 The sensitivity of the capture of IMB

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

從表3 樣品5 可以看出，金黃色葡萄球菌免疫磁珠對(duì)含有6.46 × 103CFU/mL 志賀氏菌，4.91 ×103CFU/mL 金黃色葡萄球菌的混合菌液捕獲效率為33.02% ±4.59%，這與純金黃色葡萄球菌菌液的捕獲效率(34.84% ±6.84%)相近，表明志賀氏菌不會(huì)干擾免疫磁珠對(duì)金黃色葡萄球菌的捕獲。

另外，從同時(shí)可以生長(zhǎng)這兩種菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上觀察菌落形態(tài)，免疫磁珠捕獲的菌都為金黃色葡萄球菌，而志賀氏菌基本都留在了洗下的廢液中，表明金黃色葡萄球菌免疫磁珠的特異性良好。

2.5 免疫磁分離食品樣品中金黃色葡萄球菌

利用該方法對(duì)人工接入102、103CFU/mL 金黃色葡萄球菌的羊肉卷洗水樣品免疫分離，捕獲效率分別為19.35% ±3.38%和17.74% ±2.92%，空白樣品中基本沒(méi)有金黃色葡萄球菌，結(jié)果表明免疫磁珠可以對(duì)實(shí)際樣品中的金黃色葡萄球菌捕獲，但捕獲效率有所降低，可能是由于樣品中的一些蛋白質(zhì)和抗體存在非特異性吸附，干擾了抗體對(duì)目標(biāo)菌抗原的捕獲。因此，需要進(jìn)一步探索，如簡(jiǎn)單的樣品預(yù)處理，來(lái)優(yōu)化免疫磁分離應(yīng)用在食品樣品中目標(biāo)菌的捕獲。

免疫磁技術(shù)對(duì)目標(biāo)菌快速捕獲，捕獲靈敏度高，為捕獲后快速檢測(cè)提供依據(jù)。目前，傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)方法操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足快速檢測(cè)的要求，而一些檢測(cè)方法靈敏度較低，需進(jìn)行增菌培養(yǎng)，如ELISA，乳膠凝集實(shí)驗(yàn)等，因此，利用納米磁珠對(duì)食品中的檢測(cè)目標(biāo)高效捕獲，再結(jié)合其他檢測(cè)方法對(duì)其高靈敏地快速定量檢測(cè)，是本研究的優(yōu)勢(shì)，也是最終目標(biāo)。

3 結(jié)論

本研究利用生物素化的金黃色葡萄球菌多抗(4～5mg/mL)包被直徑180nm 的鏈霉親和素磁珠，制備免疫磁珠。通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)免疫磁捕獲過(guò)程中的若干影響因素進(jìn)行了研究。

單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素影響金黃色葡萄球菌捕獲效率的主次順序?yàn)榭贵w包被磁珠加入量＞免疫捕獲時(shí)間＞免疫磁珠加入量，最佳捕獲條件為選用30μL 抗體加入量包被的磁珠，免疫磁珠加入80μL，免疫捕獲45min，在此條件下，對(duì)103～106CFU/mL 的金黃色葡萄球菌捕獲效率為33.50%～40.17%。同時(shí)，該方法具有良好的靈敏度和特異性，可初步用于食品樣品中對(duì)金黃色葡萄球菌的免疫捕獲和分離。

免疫磁捕獲技術(shù)能與多種檢測(cè)方法聯(lián)用，如量子點(diǎn)熒光免疫方法，實(shí)時(shí)熒光PCR 方法等，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌快速、準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)檢測(cè)。本研究制備了金黃色葡萄球菌多抗免疫磁珠，快速、有效地對(duì)金黃色葡萄球菌捕獲分離，捕獲時(shí)間小于1h，為下一步實(shí)時(shí)檢測(cè)提供了依據(jù)。

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