路艷麗，秦 艷，劉建福

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134)

酶催化具有高效、綠色、低碳、節(jié)能等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。同游離酶相比，通過(guò)物理或化學(xué)方法固定在載體上的固定化酶可以重復(fù)使用，因而顯著降低生物催化過(guò)程的成本，其在食品、醫(yī)藥、生物化工等領(lǐng)域應(yīng)用潛力巨大。載體與酶分子之間通過(guò)共價(jià)鍵形成固定化酶是實(shí)現(xiàn)酶固定化的主要方法之一，然而，傳統(tǒng)的載體使用前需要繁瑣的活化過(guò)程，且載體與酶發(fā)生共價(jià)結(jié)合需要較為劇烈的反應(yīng)條件，酶容易發(fā)生失活從而導(dǎo)致共價(jià)結(jié)合固定化酶的催化活力低。本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出了表面含有環(huán)氧基的活性載體，該載體使用前無(wú)需活化，其在溫和的條件下(4～25℃，pH2.0～8.0)即可與酶分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成的固定化酶活力回收率高、具有良好的操作穩(wěn)定性和較高的催化效率。低聚半乳糖能夠選擇性地促進(jìn)人體腸道內(nèi)固有的雙歧桿菌等有益菌群的增殖，抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長(zhǎng)、減少有害代謝產(chǎn)物的形成、降低癌癥等疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)的生理功能［1-2］。低聚半乳糖被公認(rèn)為促進(jìn)和維持人體健康的“益生素”。其還具有低熱能、抗齲齒、低甜度、對(duì)酸和熱穩(wěn)定等優(yōu)異的生理學(xué)和加工特性［3］。含有低聚半乳糖的食品在日本和法國(guó)被批準(zhǔn)作為“特殊健康用途食品”(The foods for specified health use)使用［4］。低聚半乳糖是歐洲市場(chǎng)的主要功能性低聚糖產(chǎn)品，其廣泛應(yīng)用于嬰幼兒乳粉、酸奶等乳制品、以及面包、餅干等烘焙食品。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究環(huán)氧基載體共價(jià)固定K.fragilis β-D-半乳糖苷酶效率的影響因素，固定化酶催化合成低聚半乳糖的反應(yīng)條件。目前國(guó)內(nèi)缺乏此方面的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

K.fragilis β-D-半乳糖苷酶與環(huán)氧基活性載體由本實(shí)驗(yàn)室制備;高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)用的標(biāo)準(zhǔn)樣品，乳糖(β-D-半乳糖-［1→4］→β-D-葡萄糖)，低聚半乳三糖(GOS)［4-0-(0-β-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃半乳糖基)-D-吡喃葡萄糖］ 購(gòu)自Sigma -aldrich 公司。乳糖為食品級(jí);其它試劑均為分析純。

掃描電子顯微鏡nano some 403 日本;傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR) VERTEX 70 德國(guó)Bruker公司;電子天平FA2004 上海舜宇恒平科技儀器有限公司;真空干燥箱FDU-810 日本制造;全自動(dòng)比表面積測(cè)定儀 理學(xué)院提供。

1.2 環(huán)氧基載體的制備與表征

分別取甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)5mL、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)5mL、甲基丙烯酸-2-羥乙酯(HEMA)4mL 與10mL 異丙醇混合作為有機(jī)相，將1g 聚乙烯戊二醇溶解于200mL 去離子水中作為水相。水相倒入500mL 四徑圓底燒瓶中，水浴加熱至65℃保溫，之后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入有機(jī)相。加入1g 過(guò)氧化苯甲酰作引發(fā)劑，75℃聚合反應(yīng)3h 得到微米尺度的球型環(huán)氧基載體。反應(yīng)結(jié)束后，用50%乙醇淋洗載體2～3 次，冷凍干燥備用。用移液器吸取無(wú)水乙醇分散的環(huán)氧基載體于導(dǎo)電膠條上，待自然干燥后，在減壓條件下噴金，然后在掃描電鏡下觀察載體的形貌。

1.3 K.fragilisβ-D-半乳糖苷酶的固定化

2g 載體加入100mL 含有5.0mg/L 乳糖酶的磷酸鉀緩沖液(pH6.5，0.05mol/L)中，在25℃、60r/min 溫和搖動(dòng)的條件下固定化2h 后過(guò)濾分離。通過(guò)測(cè)定酶液與固定化后濾液中蛋白質(zhì)含量的變化計(jì)算固定化的酶量，用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。為了研究固定化時(shí)間以及初始酶濃度對(duì)酶固定化效率的影響，分別采用初始酶濃度在1.0～6.0mg/mL，固定化時(shí)間2～14h。

1.4 酶活測(cè)定

通過(guò)測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)低聚半乳糖的形成量定義固定化酶的活力。將0.1g 固定化酶加入含有20%的乳糖溶液中，在30℃100r/min 的條件下水解5min，通過(guò)將固定化酶與底物溶液分離來(lái)終止反應(yīng)。GOS的含量用高效液相色譜來(lái)測(cè)定［5］。在30℃pH 為6.5的條件下每分鐘從20%(w/v)的乳糖溶液中水解得到1mg 的GOS 所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.5 固定化酶催化合成低聚半乳糖

以乳糖為底物，環(huán)氧基載體固定的K.fragilis β-D-半乳糖苷酶作為生物催化劑催化合成低聚半乳糖，反應(yīng)結(jié)束后采用過(guò)濾法分離出固定化酶以結(jié)束酶反應(yīng)。為了研究底物濃度與酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚半乳糖合成量的影響:在酶反應(yīng)溫度30℃下，1g 固定化K.fragilis β-D-半乳糖苷酶分別催化底物濃度為50、100g/L 和150g/L 的乳糖溶液反應(yīng)4h;1g 固定化K. fragilis β-D-半乳糖苷酶分別添加到含有100mL、150g/L 乳糖溶液的固定化酶反應(yīng)器中，分別反應(yīng)1、2、3、4、5、6h。

1.6 高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)酶水解法合成的低聚半乳糖

固定化酶催化合成結(jié)束后的溶液經(jīng)過(guò)0.45μm微濾膜過(guò)濾、稀釋后，用HPLC 分析其中的低聚半乳糖的含量。HPLC 的色譜條件為:Shodex RS-101 示差檢測(cè)器，分離柱Shodex Ks-801，流動(dòng)相為超純水，流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL。采用歸一化法算得單糖、乳糖、低聚半乳糖的含量［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的掃描電鏡圖譜

圖1 是采用懸浮聚合制備的Poly (GMA -EGDMA-HEMA)載體的表面掃描電鏡圖片。由圖可知:該載體分散性好，載體表面光滑，近似球形，該微球是平均粒徑為200μm 的均一單分散顆粒。

圖1 懸浮聚合法合成的固定化酶載體的掃描電鏡(粒徑約為200μm)Fig.1 Suspension polymerization of synthesis of immobilized enzyme carrier scanning electron microscopy (size of about 200μm)

2.2 初始酶濃度對(duì)酶的固定化效率的影響

初始酶濃度對(duì)環(huán)氧基載體固定化效率的影響如圖2，由圖可以看出:固定化酶載量隨著酶濃度的增加而增大，當(dāng)超過(guò)4mg/mL 左右時(shí)隨著酶濃度的增加酶載量下降，最大的酶載量是69.8mg/g 載體。

在初始酶濃度為1～3mg/mL 時(shí)，固定化半乳糖苷酶的酶活幾乎不變，酶活回收率約為70%，當(dāng)初始酶濃度繼續(xù)增大時(shí)，酶活下降。原因是，當(dāng)酶濃度增大時(shí)，載體表面聚集了大量的酶分子，這樣會(huì)堵塞酶活性結(jié)合位點(diǎn)，阻礙底物分子的擴(kuò)散［7］。

2.3 固定化時(shí)間對(duì)酶固定化效率的影響

固定化酶載量隨著時(shí)間的增加而增大，當(dāng)固定化時(shí)間為10h 時(shí)，此時(shí)的酶載量達(dá)到平衡，不再增加。最大酶載量為72.1mg/g(圖3)。固定化時(shí)間小于等于8h 時(shí)，此時(shí)的酶活保持在70.5%左右，當(dāng)固定化時(shí)間繼續(xù)增大時(shí)，固定化酶活就會(huì)急劇減小。引起此種現(xiàn)象的原因是當(dāng)固定化的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，環(huán)氧基與酶之間增加了好多共價(jià)環(huán)，這樣會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，從而引起酶失活［8］。

圖2 初始酶濃度對(duì)微米尺度載體固定化酶效率的影響Fig.2 Effect of initial K.fragilis β-D-galactosidase concentration on the amount of immobilized enzyme and activity recovery indicates activity recovery of enzyme

圖3 固定化時(shí)間對(duì)微米載體固定化酶的影響Fig.3 Effect of the coupling reaction time on the amount and activity of K.fragilis β-D-galactosidase immobilized onto the micro epoxy support

2.4 酶法合成低聚半乳糖反應(yīng)液的HPLC 圖譜

圖4 與圖5 分別為乳糖和低聚半乳三糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC 圖譜，保留時(shí)間分別為7.019 和8.900min。

圖4 乳糖的高效液相色譜(HPLC)Fig.4 Lactose is of HPLC

圖6 為β-D-半乳糖苷酶作用乳糖后酶反應(yīng)液中各種糖類物質(zhì)的HPLC 圖譜。根據(jù)各種糖在凝膠色譜柱Ks-801 的出峰按照分子量從高到低的順序出現(xiàn)這一規(guī)律，通過(guò)比較圖6 中各峰的保留時(shí)間與乳糖、低聚半乳三糖標(biāo)樣的出峰時(shí)間(圖4 與圖5)，可以推知，保留時(shí)間為7.380min 的為乳糖、保留時(shí)間等于與大于9.541min 的色譜峰為聚合度≥3 的低聚半乳糖，保留時(shí)間為6.619min 的峰可能為異構(gòu)乳糖。

圖5 低聚半乳糖的HPLC 圖譜Fig.5 GOS is of HPLC

圖6 K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化低聚半乳糖合成的酶反應(yīng)液的HPLC 圖譜Fig.6 Half of lactose glucoside enzyme catalysis galactooligosaccharides synthetic enzyme reaction liquid by HPLC mapping

2.5 底物濃度對(duì)低聚半乳糖合成量的影響

酶反應(yīng)體系中GOS 的含量隨乳糖濃度的增加而增大(圖7)，乳糖的最初濃度由50g/L 增加到150g/L，GOS 的最大量值相應(yīng)從12g/L 增加到40g/L。乳糖分子可以與β-D-半乳糖苷酶形成聚合物，之后斷開乳糖的β-1，4 糖苷鍵，生成半乳糖基酶復(fù)合物，半乳糖基中的C-1 被糖類物質(zhì)和水攻擊，相應(yīng)生成GOS 和半乳糖，然而這兩物質(zhì)的攻擊概率受糖類物質(zhì)的濃度影響，這就是底物濃度影響酶法合成GOS 產(chǎn)率的主要原因。

圖7 底物濃度對(duì)酶合成GOS 含量的影響Fig.7 Substrate concentration of enzymatic synthesis galactooligosaccharides influence

2.6 酶反應(yīng)時(shí)間的影響

圖8 為K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚乳糖過(guò)程中產(chǎn)物和底物的含量隨酶反應(yīng)時(shí)間變化的情況。由圖可知，隨著酶反應(yīng)的進(jìn)行，低聚半乳糖及單糖(葡萄糖和半乳糖)等產(chǎn)物的生成量增加，而乳糖(底物)的含量不斷下降，反應(yīng)4h 低聚半乳糖的含量為40g/ L 達(dá)到峰值。隨著反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，乳糖的含量基本不變、低聚半乳糖的含量緩慢減少，單糖(葡萄糖和半乳糖)含量繼續(xù)增加，這可能是由于酶反應(yīng)4h 后低聚半乳糖的合成反應(yīng)停止而合成的低聚半乳糖被β-D-半乳糖苷酶緩慢水解。

圖8 K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖反應(yīng)過(guò)程Fig .8 Half of lactose catalytic synthesis of enzyme galactooligosaccharides reaction process

2.7 固定化酶重復(fù)使用穩(wěn)定性

固定化酶重復(fù)使用穩(wěn)定性決定著催化反應(yīng)中酶的使用次數(shù)，這一性質(zhì)對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)使用至關(guān)重要。在環(huán)氧基載體上固定化半乳糖苷酶水解半乳糖得到低聚乳糖，用該固定化酶進(jìn)行此反應(yīng)，連續(xù)十次，隨著反應(yīng)次數(shù)的增加酶活力減小，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到十批次時(shí)酶活為初始酶活的81.5%。(圖9)結(jié)果表明，固定化酶在操作條件下非常穩(wěn)定，適合GOS 的大批生產(chǎn)。這是因?yàn)槎辔稽c(diǎn)共價(jià)結(jié)合的酶分子構(gòu)象穩(wěn)定性增強(qiáng)，從而防止酶分子的擴(kuò)散與變性。

3 結(jié)論

環(huán)氧基載體固定化K.fragilis β-D-半乳糖苷酶過(guò)程中，固定化時(shí)間、酶的初始濃度對(duì)共價(jià)結(jié)合在載體表面的酶量、固定化酶的活力回收率具有重要的影響。酶反應(yīng)的底物濃度、反應(yīng)時(shí)間等反應(yīng)條件對(duì)固定化K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化水解合成GOS 的產(chǎn)率具有較大的影響。通過(guò)酶法生成的GOS產(chǎn)率隨著乳糖濃度的增加而增大，當(dāng)乳糖作為底物時(shí)濃度為150g/L，此時(shí)GOS 的產(chǎn)率最大，為40g/L。用乳糖作底物，固定化K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶催化乳糖生成GOS，反應(yīng)4h GOS 的產(chǎn)率達(dá)到最大，為40g/L。

圖9 固定化酶重復(fù)使用穩(wěn)定性Fig.9 Operational stability of K.fragilis β-D-galactosidase immobilized onto the micro epoxy support during batch synthesis of GOS

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