李 鑫，趙 燕，* ，涂勇剛，李建科，喻 盼，卲蘭蘭

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047;2.南昌大學(xué)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西南昌330047;3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045)

禽蛋由蛋殼、蛋白和蛋黃三大部分組成，各部分具有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能［1］。但目前禽蛋被利用的部分幾乎只有蛋清和蛋黃，蛋殼的利用率極低，絕大多數(shù)被廢棄。廢棄的蛋殼，包括蛋殼與蛋殼內(nèi)膜，含有豐富的鈣、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、角蛋白和溶菌酶等成分［2-3］;據(jù)報(bào)道［4-8］，透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、膠原蛋白及其水解肽均具有一定的抗氧化活性。我國(guó)是世界上禽蛋生產(chǎn)和消費(fèi)最多的國(guó)家，廢棄的蛋殼造成資源的極大浪費(fèi)，也對(duì)環(huán)境造成了不小的污染［2］。基于此，對(duì)蛋殼進(jìn)行研究和深加工特別必要。目前，蛋殼的利用多數(shù)是添加到飼料中，用于動(dòng)物補(bǔ)鈣［9］，也有關(guān)于利用蛋殼制備有機(jī)酸鈣［10-12］和煅燒合成羥基磷灰石［12］的研究報(bào)道;對(duì)蛋殼內(nèi)膜的研究主要集中在對(duì)角蛋白、膠原蛋白［3］、透明質(zhì)酸［13］、硫酸軟骨素［14］等的提取分離，蛋殼內(nèi)膜功能食品的開(kāi)發(fā)［15］，蛋殼內(nèi)膜酶解［16］和蛋殼內(nèi)膜吸附作用［17］等方面，由于殼膜分離存在難度，蛋殼內(nèi)膜的實(shí)際應(yīng)用不多。為提高蛋殼的總體利用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)用蛋白酶酶解蛋殼內(nèi)膜，考察其酶解液的抗氧化能力，以初步了解蛋殼內(nèi)膜的一些功能特性，為蛋殼內(nèi)膜的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋殼內(nèi)膜 購(gòu)自于藥店;中性蛋白酶 無(wú)錫市雪梅酶制劑科技公司，50000U/g;堿性蛋白酶 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，200000U/g;胰蛋白酶 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，250U/mg;木瓜蛋白酶 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，1000000U/g;1，1-二苯基-2-苦基肼(即DPPH 自由基) 美國(guó)Sigma 公司;硫酸亞鐵、鄰菲羅啉、鉬酸銨、無(wú)水乙醇、硫酸、雙氧水、PBS 緩沖液、磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 均為分析純。

UV2800 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼珂;FA1104 電子天平 上海HANGPING;TDL-5-A 離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-4 恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶的選擇 蛋殼內(nèi)膜質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，在各種酶最適溫度和pH 下，分別添加一定量的中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解2h 后，90℃滅酶15min，3000r/min 離心5min，取上清液測(cè)定各種酶解液的總抗氧化能力，選擇酶解蛋殼內(nèi)膜的最佳蛋白酶。

1.2.2 酶解工藝單因素實(shí)驗(yàn) 在100mL 的三角瓶中加入一定量的蛋殼內(nèi)膜及中性蛋白酶，以總抗氧化能力為指標(biāo)，分別改變酶解pH、酶底比(E/S)、酶解時(shí)間、酶解溫度其中的一個(gè)因素，其他條件不變，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 酶解工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 蛋殼內(nèi)膜質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇pH、E/S、酶解時(shí)間、酶解溫度四個(gè)因素，以總抗氧化能力為指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.4 總抗氧化能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［18］的方法，以總抗氧化能力(T-AOC)為指標(biāo)進(jìn)行考查。在10mL 具塞刻度比色管中加入1mL 樣品溶液、1mL 3mol/L H2SO4溶液、1mL 0.028mol/L Na3PO4溶液和1mL 0.004mol/L(NH4)6Mo7O24溶液，加入蒸餾水定容至5.0mL，搖勻，置95℃水浴中加熱反應(yīng)，30min 后取出冷卻至室溫，以不加抗氧化劑體系為空白參比，測(cè)定695nm 波長(zhǎng)下的吸光度。

1.2.5 對(duì)DPPH 自由基清除作用的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［19］的方法，將實(shí)驗(yàn)分為樣品組、對(duì)照組和空白組。具體操作如下:在10mL 具塞試管中加入3mL DPPH有機(jī)溶液(0.1mmol/L，無(wú)水乙醇配制)，再加入0.5mL樣品溶液，然后加入1mL 水充分混勻，靜置30min 后在517nm 處測(cè)定吸光度。

清除率(%)=1-(A2-A1)/A0×100

其中，A2:3mL DPPH +0.5mL 樣品溶液+1mL 水的吸光度;A1:3mL 乙醇+0.5mL 樣品溶液+1mL 水的吸光度;A0:3mL 乙醇+1.5mL 水的吸光度。

1.2.6 對(duì)羥基自由基清除作用的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［20］的方法，略作改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)樣品組、空白組和對(duì)照組，樣品組試管中依次加入PBS 緩沖液(pH7.4，0.4mol/L)、鄰菲羅啉溶液(2.5mmol/L)、蛋殼內(nèi)膜酶解液、硫酸亞鐵溶液(2.5mmol/L)各1mL，H2O2溶液(20mmol/L)0.5mL;空白組中用1mL 去離子水代替樣品溶液;對(duì)照組中用1.5mL 去離子水代替樣品溶液和H2O2溶液。反應(yīng)在37℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行，準(zhǔn)確反應(yīng)1h 后，快速記錄536nm 處的吸光度。

清除率(%)=(A2-A1)/(A0-A1)×100

式中，A1:空白組吸光度;A2:樣品組吸光度;A0:對(duì)照組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

底物濃度為5%，酶解時(shí)間2h，分別在中性蛋白酶，堿性蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶最佳的溫度和pH 下，添加相同活力的酶，比較不同的蛋白酶對(duì)蛋殼膜酶解效果的影響。

以總抗氧化能力為指標(biāo)，考察蛋殼內(nèi)膜在不同蛋白酶作用后酶解液的抗氧化活性。由圖1 可以看出，中性蛋白酶酶解蛋殼內(nèi)膜的酶解液總抗氧化能力最強(qiáng)，堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解液總抗氧化能力相當(dāng)，木瓜蛋白酶酶解液總抗氧化能力最弱。不同蛋白酶對(duì)蛋殼膜酶切位點(diǎn)不同，使酶解液中多肽、氨基酸、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等的含量和比例不盡相同，所以抗氧化能力也有差別。中性蛋白酶酶解液吸光值隨加酶量的增加呈上升趨勢(shì)，并在酶底比為2000U/g 之后增加很快。所以本實(shí)驗(yàn)選擇中性蛋白酶為酶解蛋殼膜的最佳用酶。

圖1 不同蛋白酶對(duì)總抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of different proteases on T-AOC

2.2 中性蛋白酶酶解蛋殼內(nèi)膜單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 pH 對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液總抗氧化能力的影響酶解液pH 是決定酶活催化活性的重要參數(shù)之一，pH 過(guò)高或過(guò)低均對(duì)酶解反應(yīng)產(chǎn)生不利影響。pH7既是蛋殼內(nèi)膜水溶液的pH，也是中性蛋白酶酶解的最佳pH。從圖2 可知，用中性蛋白酶酶解蛋殼內(nèi)膜，當(dāng)pH 為7 時(shí)，酶解液的吸光度最大，該條件下總抗氧化能力最強(qiáng)。

2.2.2 酶底比對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液總抗氧化能力的影響 中性蛋白酶的酶解對(duì)象主要是蛋白質(zhì)，經(jīng)測(cè)定，所購(gòu)原料蛋殼內(nèi)膜粗蛋白的含量為58.63%，酶底比的選擇范圍參考文獻(xiàn)［21-23］。從圖3 中可知，底物濃度不變，改變加酶量，蛋殼內(nèi)膜酶解液的總抗氧化能力變化不大，說(shuō)明酶底比變化范圍在6000 ～18000U/g 時(shí)，酶對(duì)底物的酶解效果是充分的。當(dāng)酶底比為14000U/g 時(shí)，吸光度較低，可能是因?yàn)樵诿副容^充分的情況下，會(huì)將蛋殼膜酶解成一些不具有抗氧化活性的物質(zhì)。因此，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇的最佳酶底比為10000U/g。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 The results of orthogonal design

圖2 pH 對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液總抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of pH value on T-AOC

圖3 酶底比對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液總抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of E/S on T-AOC

2.2.3 時(shí)間對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液總抗氧化能力的影響 從圖4 可知，酶解時(shí)間3.5h 時(shí)，蛋殼內(nèi)膜的中性蛋白酶酶解液的總抗氧化能力最強(qiáng)，在2.5h 及3h 時(shí)，總抗氧化能力有所下降，可能是在酶解過(guò)程中，蛋殼膜被酶解成一些不具有抗氧化活性的小分子物質(zhì)。因此，選擇最佳酶解時(shí)間為3.5h。

2.2.4 溫度對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液總抗氧化能力的影響 從圖5 可知，當(dāng)?shù)皻つっ附鉁囟仍?5～55℃時(shí)，總抗氧化能力不斷提高，超過(guò)55℃，總抗氧化能力又呈降低趨勢(shì)。蛋白酶分子肽鍵具有特定的空間結(jié)構(gòu)，酶解溫度決定了蛋白酶分子的穩(wěn)定性，若反應(yīng)溫度超過(guò)某一限度，極易引起次級(jí)鍵解離，致使蛋白酶喪失催化活性;當(dāng)反應(yīng)溫度過(guò)低時(shí)，體系內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)的激烈程度大大降低，又降低了蛋白酶與底物碰撞的幾率。溫度過(guò)高或過(guò)低都不適合蛋殼膜酶解［24］。因此55℃是中性蛋白酶酶解蛋殼膜的最適溫度。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液總抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on T-AOC

圖5 溫度對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液總抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on T-AOC

2.3 中性蛋白酶酶解蛋殼內(nèi)膜的最佳工藝條件及其酶解液的抗氧化活性

2.3.1 中性蛋白酶酶解蛋殼內(nèi)膜正交實(shí)驗(yàn)最佳工藝條件的確定 由表1 及表2 可知，各因素對(duì)中性蛋白酶酶解效果的影響依次是:酶底比、溫度、時(shí)間、pH，從而選出反應(yīng)的最佳條件組合式:A1B2C3D1，即酶解時(shí)間3.0h，溫度55℃，酶底比12000U/g，pH6.0。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)最佳實(shí)驗(yàn)組合A1B2C3D1與原實(shí)驗(yàn)組合A2B2C3D1分別做三次總抗氧能力的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最佳組合A1B2C3D1總抗氧化均值為1.598 ±0.131，原實(shí)驗(yàn)組合A2B2C3D1總抗氧化均值為1.180±0.109，得出結(jié)論:最佳組合A1B2C3D1具有更高的抗氧化能力。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 2 The analysis of variance by orthogonal design

2.3.2 蛋殼膜中性蛋白酶酶解液的總抗氧化能力 比較A1B2C3D1酶解液和0.1mol/L VC分別與磷鉬酸反應(yīng)后的吸光度大小來(lái)評(píng)價(jià)其總抗氧化能力大小。蛋殼內(nèi)膜在中性蛋白酶最佳工藝條件下酶解液的總抗氧化能力值為1.598 ±0.131，0.1mol/L VC的總抗氧化能力的值為1.598 ±0.057，兩者的總抗氧化能力相當(dāng)。

2.3.3 蛋殼膜中性蛋白酶酶解液對(duì)DPPH 自由基的清除作用 二苯代苦味酰基自由基(即DPPH 自由基)是一種穩(wěn)定存在的有機(jī)自由基，若受試物能清除它，則表示受試物具有降低羥自由基、烷自由基或過(guò)氧自由基等自由基的有效濃度，打斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)的作用［25］。其單電子在515nm 附近有強(qiáng)的吸收，其乙醇溶液呈現(xiàn)紫色;如果有其他物質(zhì)提供1 個(gè)電子與此單電子配對(duì)，吸收將會(huì)消失，溶液被還原為淺黃色，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系在515nm 附近吸收峰下降程度可以直接評(píng)價(jià)試樣抗氧化活性的強(qiáng)弱。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，研究蛋殼膜在中性蛋白酶最佳工藝條件A1B2C3D1的酶解液對(duì)DPPH 自由基的清除作用，并與0.1mol/L VC對(duì)DPPH 自由基的清除作用進(jìn)行比較。A1B2C3D1組合對(duì)DPPH 自由基的清除能力為91.13% ±2.80%，0.1mol/L VC對(duì)DPPH 自由基的清除能力為98.68% ±0.40%，酶解液的DPPH 自由基清除能力略低于VC。

2.3.4 蛋殼內(nèi)膜中性蛋白酶酶解液對(duì)羥基自由基的清除作用 羥基自由基是已知最活潑的活性氧自由基，也是危害最大的氧自由基，它可以與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損害，而且反應(yīng)速度極快，尤其是羥基自由基可直接引發(fā)DNA 鏈的損傷，如DNA 斷裂、DNA 之間的交換、DNA 染色體畸變等，而這種損傷是癌癥啟動(dòng)和促進(jìn)的基礎(chǔ)［26］。蛋殼膜在中性蛋白酶最佳工藝條件A1B2C3D1的酶解液對(duì)羥基自由基的清除能力為83.67% ±6.21%，0.1mol/L VC對(duì)羥基自由基的清除能力為83.67% ±4.68%，酶解液與VC清除羥基自由基的能力相當(dāng)。

3 結(jié)論

蛋殼內(nèi)膜經(jīng)蛋白酶酶解后具有一定的抗氧化活性。中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用于蛋殼內(nèi)膜得到的酶解液表現(xiàn)出不同的抗氧化活性，且中性蛋白酶酶解液的抗氧化效果優(yōu)于其他三種酶。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，得到中性蛋白酶酶解蛋殼膜的最佳工藝條件為A1B2C3D1即蛋殼內(nèi)膜質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，pH6.0，酶底比12000U/g，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間3.0h，蛋殼內(nèi)膜酶解液的總抗氧化能力最強(qiáng)。用此酶解液與0.1mol/L VC做比較，得知酶解液對(duì)DPPH 自由基，羥基自由基清除率，總抗氧化能力，都有較好的效果。蛋殼膜來(lái)源安全，具有優(yōu)良的抗氧化性，在保健食品等方面有很大的開(kāi)發(fā)潛力。

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